这项研究得到了耶鲁人类研究保护计划机构审查委员会（IRB协议ID 2000028924）的批准。从所有注册接种的HCWS中获得知情同意。耶鲁大学人类研究保护计划的IRB确定，这项研究中进行的RT-QPCR测试和测序是对涉及人类参与者的研究的DE鉴定的Remnant Covid-19临床样本（IRB协议ID 2000028599）。

　　这项研究已招收并包括在耶鲁新天堂医院的40名HCW志愿者。志愿者在2020年11月至2021年1月之间接受了mRNA疫苗（ModernA或辉瑞）。接种疫苗的供体被分为两个主要组，以前被SARS-COV-2（已回收）或未感染（NAIVE）感染，并由RT – QPCR（2020年4月10日至2020年12月31日）和血清学证实，并确认。疫苗接种后，没有一个参与者遭受严重的不利影响。HCW遵循连续疫苗接种。在基线（接种疫苗接种之前），第一次疫苗接种剂量后的7和28，第二次疫苗接种剂量后7、28和70天收集血浆和PBMC样品。人口统计信息通过对电子健康记录（EHR）的系统评价进行了汇总，并用于构建扩展数据表1。使用Epic EHR 2020年5月和REDCAP 9.3.6软件收集了临床数据。取血是由单独的团队进行的。接种疫苗的HCW的临床信息和时间点直到处理和通过流式细胞仪和ELISA分析原始数据后才可用。ELISA，中源和流式细胞仪分析盲目。

　　全血是在肝素化的CPT血液流射剂（BDAM362780，BD）中收集的，并保持温和的搅动直至加工。在收集当天以单步标准化方法处理所有血液。在室温下以600克离心20分钟后，收集血浆样品。将未稀释的血浆转移到15毫升聚丙烯锥形管中，并在-80°C下等分并储存，以进行后续分析。根据制造商的说明将PBMC层隔离。计数之前，用PBS洗涤细胞两次。将沉淀的细胞用ACK裂解缓冲液短暂处理2分钟，然后对。使用标准锥虫蓝色染色和自动细胞计数器（AMQAX1000，Thermo Fisher）估算生存能力百分比。PBMC存储在-80°C下进行后续分析。

　　如前所述进行ELISA进行32。简而言之，将TRITON X-100和RNASE A添加到血清样品中，分别以0.5％和0.5 mg/ml的终浓度添加到血清样品中，并在使用前在室温下孵育30分钟，以降低血清中任何潜在病毒的风险。将maxisorp板（96孔； 442404，热科学）涂有50μl每孔重组SARS-COV-2 Stotal（SPN-C52H9-100μg，杂技系统），S1 N-C52H3-100μg，Acrobiosystems，Spiosystems，Spd-C52H31N33 H31n-c52H3-100 grobiosystePBS浓度为2μg/ml，在PBS中以2μg/ml的浓度为单位，并在4°C下孵育过夜。除去涂料缓冲液，并在室温下用200μl封闭溶液（含0.1％Tween-20和3％的奶粉）在室温下孵育1小时。在稀释溶液中将血浆在1：100、1：200、1：400和1：800的稀释液（具有0.1％Tween-20和1％奶粉的PBS）中稀释，并在室温下加入100μl稀释的血清。人类抗尖峰（SARS-COV-2人类抗尖峰（AM006415）（91351，主动序）和抗核糖剂SARS-COV-SARS-COV-2人类抗核糖膜（1A6）（MA5-35941（MA5-35941）（MA5-35941，Active Motif）静脉稀释，以产生标准曲线。HRP抗人IgG抗体（1：5,000; A00166，Genscript）在稀释溶液中稀释到每个井中，在室温下孵育1小时后，用PBS-T将板清洗六次。然后以450 nm和570 nm的波长读取板。

　　对于体外刺激，用HLA I类和HLA-DR肽池刺激PBMC，每肽的浓度为1-10μgml-1，并培养7天。在第0天，将PBMC解冻，计数和镀以200 ul的RPMI 1640培养基（GIBCO）的总共5–8×105个细胞，并补充了1％丙酮酸钠（NEAA），100 u/ml青霉素 - 链霉素（BioChrom）（BioChrom）和10％co2 co2 co2 co2和5％。在第1天，洗涤细胞，并使用：pepmix sars-cov-2尖峰糖蛋白池1和池2（genscript），pepmix p.1 sars-cov-2尖峰糖蛋白池1和池2（JPT）（JPT）和pepmix sars-cov-2-sars-cov-2-2核蛋白（JPT）。用PBS（未刺激）进行刺激对照。肽池以1μgml -1的每肽使用。在37°C，5％CO2进行6天进行孵育。在第6天，将细胞用10μgml-1每肽重新刺激，然后孵育12小时，最后6小时在10μgml-1 brefeldin A（Sigma-Aldrich）的存在下。孵育后，用PBS 2 mM EDTA洗涤细胞，并准备通过流式细胞仪进行分析。

　　抗体克隆和供应商如下：BB515抗HHLA-DR（G46-6，1：400; BD Biosciences），BV605抗HCD3（UCHT1，1：300; Biologend），Bv785抗HCD19（sj25c1，1：3300; （SK3，1：200;生物学），APCFIRE750或BV711抗HCD8（SK1，1：200; Biology），Alexafluor 700抗HCD45RA（HI100，1：200; BD Biosciences），PE Anti-HPD1，PE Anti-HPD1（EH12.2H7; Biology; apc or pe38; apc or pe38''38 eat。 1:50;生物学），BV711抗HCD38（HIT2，1：200;生物学），BB700抗HCXCR5（RF8B2，1：50; BD Biosciences），PE-CF594抗HCD25。抗HCD19（SJ25C1，1：300; Biology），Bv421抗HCD138（MI15，1：300; Biology），Alexafluor700 anti-HCD20（2H7，1：200; Biology），Alexafluor 647 Anti-HCD27（M M-T271）抗希格（IA6-2，1：400;生物学），PERCP/CY5.5抗HCD137（4B4-1，1：150; Biology）和PE抗CD69（FN-50，1：200; Biology）和APC抗HCD40L（24-31;生物学）。简而言之，在96孔U底板中以每孔1-2×106个细胞以1-2×106的细胞将新鲜分离的PBMC铺板。在4°C下，将细胞重悬于活/死固定的水上（Thermo Fisher）20分钟。洗涤后，在室温下用人类信任FCX（生物学结构）封闭细胞10分钟。在室温下，将所需染色抗体的鸡尾酒直接添加到该混合物中30分钟。对于次要污渍，首先洗涤细胞并吸出上清液。然后在每个细胞颗粒中，在4°C下加入30分钟的次级标记鸡尾酒。在分析之前，将细胞洗涤并在4°C下重悬于100μl4％PFA中30分钟。对Attune NXT（Thermo Fisher）的分析。使用Flowjo软件版本10.6软件（树星）分析数据。用于识别每个细胞子集的特定标记集在扩展数据中总结了图4。

　　将TMPRSS2-VEROE6肾上皮细胞培养在补充1％丙酮酸钠（NEAA）的DMEM中，在37°C和5％CO2下培养了10％FBS。该细胞系是从美国型培养物中获得的，并测试了对支原体污染的阴性。SARS-COV-2谱系A（USA-WA1/2020）是从BEI资源（NO.NR-52281）获得的，并在TMPRSS2-VEROE6中进行了扩增。细胞以0.01的多种感染感染3天以产生工作库存，并且在孵育后，通过离心（450g持续5分钟）阐明上清液，并通过0.45 µm的滤波器过滤。然后将沉淀的病毒重悬于PBS中，并等分以在-80°C下储存。使用TMPRSS2-VEROE6通过标准斑块测定法测量病毒滴度。简而言之，使用300 µL的串行折叠病毒稀释液在补充了Nahco3，4％FBS和0.6％Avicel RC-581的MEM中感染Vero E6细胞。感染后48小时，通过将10％甲醛固定1小时，然后在20％乙醇染色中固定0.5％的晶体紫罗兰色，从而在感染后48小时解决斑块。将板冲洗在水中以枚举斑块。所有实验均在耶鲁环境健康与安全办公室的批准中在生物安全3级实验室中进行。

　　SARS-COV-2样品被测序为YALE SARS-COV-2基因组监视计划在美国康涅狄格州的每周监视计划的一部分。如前所述，对谱系进行测序并分离。34。简而言之，从去识别的残留鼻咽拭子中提取核酸，并使用我们的多重RT-QPCR变体测定法进行了测试，以选择Suequencing35,36的N1循环阈值35或更低的样品。图书馆由Illumina Covidseq Test RUO版本的略微调整版本编写。耶鲁大学基因组分析中心在Illumina Novaseq上测序了多达96个样品的汇总文库（配对端150）。分析数据并使用IVAR（版本1.3.1）37生成共识基因组。感兴趣和关注的变体，具有关注突变（E484K）的谱系以及其他作为对照的谱系进行了病毒分离。总共将16种病毒分离为属于12个谱系（扩展数据图3，扩展数据表2）。另外，从BEI获得了祖先谱系A病毒和谱系B.1.351病毒。

　　将选择用于病毒分离的样品在DMEM中以1:10稀释，然后通过45 µM滤光片过滤。将样品从1:50到1：19,531,250串行稀释十倍。随后将稀释度与TMPRSS2-VEO E6在96孔板中孵育，并在37°C下吸附1小时。吸附后，加入替换培养基，并在37°C下孵育5天。收集，冷冻，解冻并遭受RT – QPCR的细胞培养物中的上清液。如上所述，将新鲜培养物接种了裂解物，以进行病毒膨胀。随后通过减少具有多重变体QPCR测定的细胞培养物中的循环阈值值来证实病毒感染。按照与上述相同的方法将扩展的病毒重新计数，并将基因组序列上传到GenBank（补充数据表2），并且对齐的共识基因组在GitHub上可用（https://github.com/grubaughlab/paper_2021_nab-variants）。NextClade V1.5.0（https://clades.nextstrain.org/）用于生成系统发育树（扩展数据图3），并与Wuhan-Hu-1参考菌株相比，编译了病毒分离株中氨基酸变化的列表（Extended数据表2）。基于爆发的键峰氨基酸差异是鉴定的。INFO突变跟踪器20。

　　如前所述分离出接种疫苗的HCW的血清，然后在56°C下进行30分钟。从1：3到1：2,430与SARS-COV-2变体孵育1 h，在37°C下孵育1 h，六倍的串行稀释等离子体。随后将混合物与TMPRSS2-VEROE6在12孔板中孵育1小时，以吸附。然后，将细胞用含有Nahco3的MEM覆盖，4％FBS和0.6％的Avicel混合物叠加。感染后40小时，通过将10％甲醛固定1小时，然后在0.5％的晶体紫罗兰色中染色。所有实验均与基线对照的血清同时进行，以既定的病毒浓度，每孔产生60-120张斑块。

　　使用GraphPad Prism 8.4.3，JMP 15和R 3.4.3对患者样品进行了所有分析。通过运行参数（ANOVA）统计检验分析了多组比较。如图传说中所示，使用Tukey和Dunnett的测试对多次比较进行了校正。对于稳定组之间的比较，使用双面未配对的t检验进行比较。使用线性混合模型评估了峰值突变的效果，该模型具有对数转换的PRNT50的结果，并为每个参与者计算了随机效应。这是使用R 4.0.1中的“ LME4”软件包（参考文献38）完成的。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。