从Envigo获得了八周大的雄性和雌性C57BL/6 N小鼠。TLR9FL/FL（C57BL/6J-TLR9EM1LDM/J）小鼠带有LOXP位点的TLR9侧面外显子1，IFNAR1FL/FL/FL（B6（CG）-IFNAR1TM1.1EES/J）小鼠具有LOXP位点侧面/β的FLAR EXON 3的tlagon-nar1tm1.1eees/j（B6.129S1-relatm1ukl/j）带有loxp位点的小鼠，侧面的外显子1和sTing1-Knockout小鼠C57BL/6J-sting1gt/j;Goldenticket（TMEM173GT）小鼠是从杰克逊实验室获得的，并在机构设施中繁殖。除非另有说明，否则所有小鼠在实验开始时均为八周龄。所有小鼠均组成（12 h：12 h的光：黑暗周期，灯在07:00，温度为20–22°C，湿度为30–60％），并随意获得食物和水（小鼠在实验前一周切换到单个外壳）。所有实验组均为混合性别，由大约相等数量的男性和女性组成。所有程序均获得西北大学的动物护理和使用委员会（协议IS00002463和IS00003359）以及Albert Einstein的动物护理和使用委员会（协议00001289和00001268）的批准，该委员会符合美国国立国家卫生学院的合规性委员会（以及在Aarhus National National Antials委员会）的合规性（2021-15-0201-00801）。
对于所有分析，小鼠通过宫颈脱位，背侧海马立即解剖并在液氮中冷冻。将冷冻组织存储在-80°C下，直到进行蛋白质或RNA提取。
使用FASTQC46（V0.10.1）评估读取质量，以识别平均质量较低，适配器污染或PCR扩增的重复序列的测序周期。使用带有默认参数的Samtools FlagStat分析对齐质量。如先前所述，在视觉上检查了数据质量55。此外，我们通过分析使用MEDIPS R Package的所有样品的平均每个基本覆盖率和饱和相关性来评估样品是否足够深到足够深的深度。饱和函数将每个库的读数的初始数量（十个相等大小的子集）的分数分配，并绘制收敛性。使用Pearson相关（功能MEDIPS. -CRYATION）评估生物重复之间的相关性。只有通过所有质量标准的数据用于进一步分析。使用间隙比对将数据与基因组对齐，因为RNA转录物需要剪接，因此读取可能跨越两个遥远的外显子。使用Star Aligner58（2.3.0E_R291）和默认选项将读取与整个Mus Musculus MM10基因组对齐，从而生成映射文件（BAM格式）。如前所述，读取与小鼠基因组M.肌肉MM10对齐，并使用特征计数为55。折叠变化显着不同（错误发现率校正P <0.05）的基因被归类为上调或下调。
CFC后96小时收集新鲜的背部海马组织。根据已建立的方案57分离核。将RNase抑制剂添加到6倍均匀的缓冲液稳定主混合物中，最终浓度为1.2UμL -1。使用聚晶均质剂匀浆组织1.5分钟。将样品与50％碘二醇溶液（50％iodixanol中的1倍均匀化缓冲液）重悬于，以使最终浓度为25％碘二烷醇。将35％碘糖溶液的三毫升（含有480 mM蔗糖的1倍均质化中的35％碘糖醇）添加到新的15 mL猎鹰管中。在35％的碘二烷醇混合物上方，将29％碘糖溶液的三毫升（1倍含有480 mM蔗糖的1倍均化缓冲液中的29％iodixanol）分层。将4 mL 25％碘醇溶液分层在29％的溶液上。在摇摆的桶离心机中，将核以3,000克离心20分钟。离心后，核存在于29％和35％碘二醇溶液的界面处。该带有细胞核的条带以300μl的体积收集，并转移到预冷的管中。分离后，对核进行计数并重悬于荧光激活的细胞分选（FACS）缓冲液（1％BSA，1 mM EDTA和PBS中的0.2Uμl-1 RNase抑制剂），每毫升为2×106核。通过GFP表达在高速细胞分系仪流式细胞仪（Beckman Coulter MoflowxDP细胞分系器）上通过GFP表达进行分类。有关详细的门控策略，请参见补充图1。
SnRNA-Seq库是从铬控制器（10倍基因组学）上捕获的10,000个单个细胞产生的。在单个细胞 - 凝胶珠乳液微反应器中产生cDNA，同时使用铬铬在细胞和分子水平上添加条形码下一个GEM单细胞3'Kit v3.1（10x Genopics Kit Kit 1000268）。将来自单个细胞的条形码cDNA合并为剩余的库过程。独特的分子条形码（UMIS）阻止了放大伪像歪曲分析。The libraries were analysed on a Fragment Analyzer 5200 (Agilent Technologies) to ensure a normal size distribution with an average size of 450 bp and sequenced on an llumina Sequencer with the following read lengths: 28 bp for read 1, 10 bp for i7 index, 10 bp for i5 index and 90 bp for read 2 at a read depth of 20,000 reads per cell.生成五个库并分析（补充表6）。
将每个样品的FASTQ格式的测序文件与鼠标MM10基因组v4.0.0对齐，并使用CellRanger软件v7.0.1转换为基因计数矩阵。使用Seurat R软件包v4.3.0进行质量控制和下游分析。使用R软件包SCDBLFINDER v1.13.13检测并删除了双线。使用R软件包Soupx v1.6.2检测并校正环境RNA。从进一步分析中排除了少于1000个基因，4,000多个检测到的基因或超过5％的线粒体基因的细胞。使用seurat sctransform函数对样品进行标准化，然后使用seurat函数进行集成和聚类。进行差异基因表达分析以比较每个群集中不同样品的细胞。变化超过1.5倍，调整后的P值小于0.01的基因被定义为显着。通过比较靶标两个基因的余弦相似性和随机选择的基因，评估了两个基因的共表达。在每个群集上进行基因集富集分析，使用R软件包FGSEA v1.20.0比较具有不同条件与基因本体数据库的样品。调整后的P值小于0.05的途径被认为显着富集。使用Reactome Patway数据库（版本86）58进行途径分析。大脑和血液衍生细胞群的公认标记被用来定义单个簇59,60。
使用搜索工具检索相互作用的基因/蛋白质（String）数据库（版本11.0）61用于上调基因，对功能蛋白关联网络分析进行了分析。将网络应用于Kmeans聚类，将簇数设置为4。使用小鼠基因组数据库（MGI）批次查询基因组分析工具（V6.23）鉴定了与炎症响应相关的基因。选择标准是使用IMP（根据突变表型推断），IEA（根据电子注释推断）和IBA（从祖先的生物学方面推断出）证据代码中的“炎症反应”（ID：GO：0006954）中的GO术语分类（0006954）。使用Panther分类系统发动机（版本17.0）对上调基因的功能分类进行。通过Panther代表过度分析基因（测试类型：Fisher；校正：FDR；功能分类：Panther Go -Slim -Slim生物学过程，Mus Musculus -Reflist（21997））。
根据制造商的指示，使用小鼠先天和适应性免疫反应RT²PRILILERPCR阵列（Qiagen，330231 PAMM-052ZA）分析了最近和远程记忆之间炎症相关基因的差异表达。使用Purelink RNA迷你试剂盒（Thermofisher，12183018 A）从背侧海马中提取总RNA。在CFC后解剖96小时（n = 5，合并）或21天（n = 5，汇总），重悬于裂解缓冲液中，在液氮中冷冻闪光并储存在-80°C下。根据制造商的说明提取RNA。使用RT2第一链试剂盒（Qiagen，330401）合成cDNA。对于每个实验组，将500 µg的总RNA用于cDNA合成。通过将RNA与2 µL缓冲液混合在10 µL总反应量中，制备基因组DNA消除反应。使用RT2 SYBR绿色QPCR策划者在每个样本（最近的远程）中使用RT2 SYBR绿色QPCR策划者进行实时PCR反应。PCR反应是在应用的生物系统7300实时PCR系统中进行的，具有以下循环条件：95°C，10分钟；然后40个95°C，15 s的周期；60°C，1分钟。通过从每个靶基因的CT值中减去6个管家基因的平均CT值来计算每个基因的ΔCT值。从ΔΔCT值计算出最近的和远程存储器之间的差异表达。
使用Rneasy Plus迷你试剂盒（Qiagen，74136）提取总RNA。对100 ng的总RNA Primescript RT试剂试剂盒（Takara RR037A）进行了逆转录。实时PCR分析使用SYBR绿色检测系统（Applied Biosystems，4367659）在QuantStudio 6 Flex仪器（Thermofisher）上进行，对TLR9（330001/PPM04221A-200）进行了特定的引物，（330001/ppm41490a-200）（全部来自Qiagen）。管家基因GAPDH和HPRT用于归一化。使用两个管家基因的平均CT计算靶基因的ΔCT。每个实验组的mRNA量相对于幼稚组表示，并计算为。
如先前所述62进行胞质DNA提取。使用线粒体/细胞质分馏试剂盒（ABCAM，AB65320）从新鲜组织（背侧海马）中提取DNA，并用1 mg Ml -1蛋白酶K在55°C下用1 mg ml -1蛋白酶K处理清除的提取物，用55°C进行1小时，用苯酚：氯仿：1 MG MG ML -1 MG ML L -1 MG ML rnase cretienty cretient and cress cress。用苯酚：氯仿和氯仿提取。通过使用引物进行VGLUT1进行40周期PCR反应（也称为SLC17A7）（正向：GTGGAAGTCCTGGAACTGC），对纯化的胞质DNA进行了核DNA污染。为了克隆DsDNA，将样品用DNA聚合酶I处理，大（Klenow）片段（1 U µg -1 DNA; NEB），补充了每个DNTP的33 µm，持续15分钟。如上所述，用乙酸钠/乙醇沉淀DNA，并溶于水中。根据制造商的说明，将DNA样品用TAQ聚合酶（NEB）处理20分钟20分钟，并立即克隆到PCR4-TOPO载体（Invitrogen）中。通过将2μl的Topo克隆反应添加到一个射击的化学胜任大肠杆菌的小瓶中，从而转化了一个射击竞争的细胞。将细胞在冰上孵育30分钟，在42°C的情况下在42°C下热震30 s，并立即转移到冰上。5分钟后，加入250μl的室温SOC培养基，并在37°C下水平放置管（200 rpm）1小时。将细胞以6,000 rpm的含量颗粒，持续10分钟，重悬于50 µL的SOC培养基中，并在预热的选择板上扩散。将板在37°C下孵育过夜。将每个板上的所有菌落捡起，并将其放入装有50 µL PBS的96孔板的单个井中。克隆的DNA片段的序列通过直接集菌测序（ACGT）确定。
如前所述63，分离出产后第0天（P1）C57BL/6 N雄性和雌性小鼠的海马。63。将细胞以每CM2的50,000个细胞的密度为50,000个细胞涂在14毫米直径的玻璃碟（Mattek，P35G-1.5-14-C）中，并在神经元培养基中生长（Neurobasal培养基（含有1 mm Glutamax和2％B27）的神经元培养基。在治疗前，将神经元在体外培养14天。用25μMN-甲基 - 天冬氨酸（NMDA）在新鲜神经元培养基中处理10分钟，洗涤两次，并与picogreen（dsdna Dye，1：20,000），细胞膜（细胞膜染料，1：1,000）和Mitotracker（Mitotracker（Mitotracker（Mitotracker）（Mitockondracker（MiTotracker）培养基（MITOCHONDRACKONDRATRIAT），MEDER介质，Neuron neuron，1：20,000 ne：20,000,000,000 ,，在尼康W1旋转盘共焦显微镜（西北大学晚期显微镜中心）上成像细胞，在100倍放大倍数时每10 s帧1帧。
用腹膜内注射240 mg kg-1 avertin，并在磷酸盐缓冲液中用冰冷的4％多聚甲醛（pH 7.4，150 mL）在腹膜内注射240 mg kg-1 avertin，并在腹膜内注射240 mg kg-1 avertin（pH 7.4，150 mL），将小鼠麻醉。将大脑在同一固定剂中去除并固定24小时，然后在磷酸盐缓冲液中分别浸入20％和30％的蔗糖中24小时。将大脑冷冻，切割50μm的切片，用于在自由浮动的免疫组织化学中，分别在补充表7和8中列出了主要和二级抗体。除了制造商的验证外，所有主要抗体均通过与无主要对照样品进行比较进行了验证。
使用紫藤floribunda凝集素（WFA）染色可视化PNN，这是一种广泛使用的PNN可视化方法40。WFA染色是根据制造商的说明进行的。简而言之，内源性过氧化物酶被过氧化氢灭活。链霉亲和素/生物素和无碳纤维阻塞后，将切片与生物素化的WFA（载体生物代剂），Vectastain ABC系统以及荧光素，香豆素或杜鹃花异硫胺异硫氰酸酯（Akoya Biosciences）一起孵育。使用FluorSave（Millipore-Sigma）安装部分。
使用Leica DFC450 C数码相机捕获低磁化图像（最高60倍放大），而高磁化图像和Z-stacks（60–100×放大倍率）使用共聚焦激光扫描显微镜（Olympus fluoview FV10I）捕获。使用ImageJ进行所有定量。首先鉴定出γH2AX阳性神经元的簇，并在周围（〜100 µm×100 µm）区域进行分析。因此，数字代表了感兴趣的区域，而不是CA1子场的平均值。为了进行时间表分析，我们在每只小鼠的180个神经元中计算γH2AX神经元（连续3个60个神经元切片）。每组6只小鼠，每个时间点1,000个神经元。在大多数其他分子靶标中，我们使用60–100x物镜计算每只小鼠的60个神经元。所有图像均转换为二进制格式，对于显示γH2AX的每个单元格，我们确定了背景，并在背景信号高于背景信号的两次中应用了阈值。因此，我们在不同的抗体和条件上获得了相似的结果。所有分析均使用斐济/ImageJ进行。用于基于对象的共定位的JACOP插件通过比较颜色通道核的质心的位置来确定共定位。然后使用它们各自的坐标来定义与光学分辨率等于或之下的距离分离的结构45。使用体积和3D查看器插件用于Z堆栈的3D重建，而绘图曲线和表面绘图函数用于分析较低（40×）放大倍数的簇。COLOC2用于确定不同荧光团信号的表达水平的相关性。分析的粒子，图轮廓和测量功能用于确定指示信号之间的数量，大小，分布和距离。
幼稚小鼠（n = 4）或经过CFC（n = 4）的小鼠在96小时后用冰冷的0.1 m PBS和PBS中的4％多聚甲醛灌注，并如上所述进行处理。根据制造商的说明进行了rnascope。使用可视化HSP90B1和DCX mRNA和Neun蛋白RNASCOPE多重荧光试剂盒V2（ACD Biotechne，323100）和RNA-蛋白质共探测辅助辅助试剂盒（ACD Biotechne，323180）。简而言之，将载玻片在60°C的烤箱中干燥30分钟，在乙醇中脱水，在室温下用过氧化氢处理10分钟，在水中洗涤并在共检测目标检索试剂（约98°C）中煮沸5分钟。将切片与抗Neun抗体（1：500，Sigma，ABN78）一起孵育，并用10％中性缓冲福尔马林（VWR，Gen0786-1056），蛋白酶Plus固定，并用无菌水冲洗。通过与以下探针孵育部分：MM-HSP90B1-C1（ACD Biotechne，556051），MM-DCX-C2（ACD Biotechne，478671-C2），进行杂交步骤进行杂交步骤。320871）在40°C下持续2小时，并在5×盐水柠檬酸钠中储存过夜。用AMP 1和AMP 2扩增杂交。在40°C下进行所有扩增和发育，并在每个步骤后进行ACD洗涤缓冲液中的2×2分钟。对于C1探针TSA生动的荧光团试剂盒520（Biotechne，7523），用于C2和C3，使用了阳性和负探针TSA生动的荧光团套件650（7527）。将切片与山羊抗兔Alexa-568二抗（1：300，Invitrogen，A11036）和DAPI溶液（ACD BIO）一起孵育，并用延长的金抗固定式山脉（Thermofisher Scientific，33342）安装。使用Andor的Andor BC43旋转磁盘共聚焦显微镜（Oxford Instruments）获取图像 （6.5μm像素； 2,048×2,000像素产生16位，单色图像），没有嵌套。用405 nm，488 nm，561 nm和638 nm的4个固定波长照亮样品。随后使用60倍物镜以更高的放大倍率对使用10倍物镜的3×3缝线（10％重叠）获得背面海马概述（10％重叠）。阈值使用分析粒子函数在ImageJ中使用每只鼠标四个切片进行阈值进行图像分析。每片60个神经元（每只小鼠240个神经元）分析颗粒数量。
如前所述29在自动系统（TSE系统）中进行CFC。简而言之，将小鼠暴露于新的环境中，然后进行脚冲击（2 s，0.7 mA，恒定电流）。通过将小鼠暴露于3分钟的新环境中，然后进行30 s的音调（75 dB SPL，10 kHz，200 ms脉冲），15 s痕迹和脚冲击（2 s，0.7 mA，常数电流）63。如TFC所述进行了DFC，只是省略了痕迹，以便震动立即跟随音调结束。在指示的时间点，通过将它们重新曝光到相同的上下文（上下文测试）或在不同上下文中显示的音调（TFC或DFC之后的音调测试），通过将它们重新展示到相同的上下文（上下文测试），对它们进行内存检索。测试包括在调节环境中的3分钟，在此期间每10 s测量冻结。冻结表示为小鼠一动不动的观察总数的百分比。活性是通过红外光束系统自动记录的，并在CM S -1中表达。使用野生型小鼠进行的单个实验不是在同窝窝仔上进行的，因此我们没有采用随机程序，但是在我们设施中繁殖的所有遗传线时，同窝窝随机分配给了不同的实验组，以最大程度地减少垃圾效应。行为测试是盲目执行的，要么是由没有意识到治疗方法的实验者进行的，因为解决方案是编码的，要么是实验者不知道实验设计的。执行测试的实验人员不知道编号代码。
如先前所述，将双引导的插管（塑料一）植入背侧海马17。用1.2％的三纤维乙醇（Vol/vol，avertin）麻醉小鼠，并使用立体静脉仪器植入双侧26口径插管（KOPF，Model 1900）。背侧海马的立体定位坐标为1.8毫米后部，±1.0 mm横向和腹侧2.0毫米。
使用微灌注泵（型号UMP3T-1 Ultamicropump 3型型号UMP3T-1 Ultamicropump 3），所有寡核苷酸和药物以每侧0.25μl的体积为0.25μl的体积以0.15μlmin-1的速度注射到背侧海马中。ODN2088分别以4和8 nmol的剂量注射125 ng和300 ng。基于试验实验，将CGA和STING拮抗剂以每只小鼠250 nl的剂量和50 ng的剂量注射。
DNase I (Sigma-Aldrich D4513, lot SLCQ3662, diluted in water) was injected intraperitoneally with 50 U DNase I in 200 µl saline, 24 h and 12 h before and 1 h after CFC, or intrahippocampally with 50 U DNase I per mouse at volume of 0.5 μl per side, at a rate of 1 μl min−1 24 h before and 1 h after test.将DNase I和S1核酸酶（Thermo Scientific，EN0321）处理在剂量5 U DNase I+10U S1的20％甘油/人造脑脊液中，媒介物：20％甘油/人造甘油/人造脑脑脊髓液体4 H。治疗时间表和剂量是根据已发布的Data64设计的，包括高剂量和低剂量，以及预先进行预测试和测试前注射。
为了耗尽小胶质细胞，将pexidartinib（PLX-3397，HY-16749批次：212013 Medchemexpress）以290 ppm的浓度（W.F. Fisher and Son）浓度以5053 Picolab啮齿动物饮食20的形式。在测试前将小鼠喂四个星期。Labdiet 5053用作对照饮食。在实验结束时，收集了所有大脑以进行组织学确定套管的位置或免疫组织化学。
所有病毒（补充表9中列出）均以每侧0.5μl的体积为0.5μl，后部为1.8 mm，±1.0 mm侧向和腹侧2.0 mm，速率为0.15μlmin -1。在输注病毒时，小鼠八周大。CFC和记忆测试是从第13周到第17周进行的。行为测试完成后的一天，心内灌注小鼠，并收集了所有大脑，并通过对GFP或MCHERRY的免疫组织化学分析确认了病毒扩散。
我们使用强大的活性RAM System31与人类FOS最小启动子耦合的强大活性RAM System31使用强力活性RAM System31在CFC期间在CFC的背部海马中标记了CA1神经元，该细胞（PRAM）的四个串联重复序列（PRAM）（PRAM）（PRAM）最近所述。简而言之，我们将两组野生型小鼠放在强力霉素饮食上，前一天，在注射AAV2/9-PRAM：D2TTA-TRE：NLS-MKATE2上，并在9天后将其脱掉饮食，其次是CFC，其次是CFC。在没有强力霉素的情况下，将小鼠不受干扰地在我们的测试设施中持续了两天。两天后，将小鼠放回多西环饮食上，在CFC后96小时，一组经历了记忆重新激活（上下文测试），并在1小时后进行安乐死。另一个无反应组作为对照组。后来的组仅在内部使用，以确保没有内存重新激活的情况下没有FOS响应。
使用功率分析（在http://www.stat.ubc.ca/~rollin/stats/ssize/n2.html）上确定检测预期效应大小的统计能力。对于所有提出的实验，将最小功率设置为0.90，以检测α= 0.05（双面测试）的平均值差异为20％至40％，为15％的常见标准偏差。为了防止垃圾效应，将同一垃圾的小鼠分配给不同的实验组。意识到该构建体的实验者注入了病毒，但随后将小鼠分配了实验室技术人员的编码数字。该代码在量化后和分析之前可用。使用GraphPad Prism进行统计分析。排除了病毒输注或插管的小鼠，在CA1中表达病毒表达少于70％的小鼠被排除在外。单向方差分析之后进行了Tukey测试，用于三个或多个实验组的事后比较（仅在ANOVA显着时），而学生的t检验用于比较两个实验组。通过莱文对方差平等的测试证实了方差的同质性。在指定的数据上，我们进行了相关分析并报告了Pearson的R系数。使用卡方检验确定共定位或激活（％）的显着变化。使用Bonferroni校正的Alpha水平进行卡方检验后的先验确定的事后分析，因为原始的总α水平（α= 0.05）除以正在进行的测试数量。这些调整后的α水平被用作每个单独测试的新显着性阈值。所有比较均使用两尾测试进行，所有情况的P值均设置为<0.05，对于显着差异。数据表示为平均值±S.E.M.统计学上的显着差异表示为 *p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001， **** p <0.0001和***** p <0.00001。所有细胞和分子效应至少显示了六个生物学重复（图1E和2E以及扩展数据图3F和9）。对所有时间课程进行了两次实验重复，TLR9-KO，RELA-KO，IFNAR1-KO和WT-CRE实验（图1C，D，D，2A – D和5A，C和扩展数据图2-4、11和12）。使用野生型，病毒特异性和细胞特异性对照组，将所有显着的行为效应至少复制三倍。用四种不同的方法（Bulk RNA-Seq，定量PCR阵列，定量PCR和SNRNA-Seq）复制所有主要基因表达效应。相对于初始或代表性实验产生相似的结果。
使用Adobe Illustrator CS6（Adobe，V27.5，RRID：SCR_010279）创建和编辑数字。无花果。1A，1B，2A，2E，3A，3C，3D，4A和5A以及扩展数据图。使用Biorender.com创建了4C，4D，5A，5B，5C，5D和补充图1。
这项研究中使用的所有动物程序均由西北大学IACUC，Albert Einstein医学院IACUC和丹麦国家动物实验委员会批准，并遵守国立卫生研究院的联邦法规。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。