材料如下：[U-13C]葡萄糖（剑桥同位素，CLM-1396），[U-13C]谷氨酰胺（剑桥同位素，CLM-1822），C57BL/6J（UTSW core or Core或Jackson Breecy or Core或Jackson Breending）和LIPT1N44S Inne-Inkin-Ink-Inkin-Innem in him house ins in house ins in house in house in house in house in house in house in house inshouse）5。
LIPT1缺陷的个体在图4F中提供了临床数据，扩展数据图6E，F先前描述了5。该患者参加了一项前瞻性，非随机，非盲目观察性研究，其总体目标是在任何年龄的患者中发现新的代谢性疾病相关基因，并表征这些患者的代谢表型（NCT02650622）。该研究得到了德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）的机构审查委员会（IRB）的批准，并获得了患者父母的书面知情同意。在UTSW，其附属医院和其他合作医院都确定了有资格参加该研究的患者和家人。入学后，研究对象为代谢组学和基因组学提供了血液，并且对数据进行基于研究的综合分析允许将潜在的致病基因组变异置于实验室的功能分析。这项研究纯粹是观察性的，因为没有提出过治疗干预措施，尽管患者纵向遵循以了解每种疾病的自然病史以及作为常规临床护理的一部分所产生的疗法的作用。计划的总入学人数超过1,500名患者，目的是代表队列中许多罕见情况。
中期期间胎儿组织的数据可从Encode21,35,40鼠标开发矩阵（https://www.encodeproject.org/mouse-development-matrix）获得。We downloaded the tsv files from the polyA plus RNAseq assay with the following identifiers: ENCFF262TPS (E11.5 liver -1), ENCFF414APX (E11.5 liver-2), ENCFF173NFQ (E12.5 liver-1), ENCFF144DHB (E12.5 liver-2), ENCFF971KKK (E13.5 liver-1),ENCFF042DVY（E13.5 liver-2），Encff770SOB（E10.5 HEART-1），ENCFF351QKG（E10.5 HEART-2），ENCFF159DWP（E11.5 HEART-1），ENCFF168UJM（E11.5 HEART-2），ENCFF484QWQ（ENCFF484QWQ E12.5 HERT-129 HORK-129 HORK）（E12.5 HERT-1）ENCFF148BEQ（E13.5 HEART-1），ENCFF836QQS（E13.5 HEART-2），ENGFF145PTV（E10.5前桥1），Encff476Adm（E10.5 forebrain-2），Encff606uho（E11.5（E12.5前脑1），ENCFF046RSQ（E12.5前脑-2），ENCFF960KJV（E13.5前桥1），ENCFF356CTG（E13.5前脑-2）。胎盘RNA转录本丰度从基因表达综合（GEO）登录代码GSE100053获得。根据已知的代谢基因37,38,39过滤表达数据，人类基因映射基于同源数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）。
使用GeoQuery Package36（https：//doi.org/10.18129/bi.geoquery）使用GeoQuery Package36（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）获得胎盘基因表达数据。（https://www.bioconductor.org/）。基于已知的代谢基因37,38,39过滤数据，并由京都百科全书和基因组途径的京都百科全书对metaboAnalyst_kegg R软件包（https://github.com/github.com/xia-/xia-lab/metaboanalystr）进行了分类。人与小鼠基因映射基于同源数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）。
所有程序均由UT西南动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并根据《实验动物的护理和使用指南》批准。所有小鼠均在无病原体环境（温度为20–26°C，湿度30-70％）中，光照12小时：黑暗周期和喂食饮食（Teklad 2916）。健康的8-15周大，幼稚的怀孕雌性与适当的基因型的可靠螺柱在05:00至07:00之间建立了交配。第二天早上，表现出阴道塞的女性被确定为怀孕，并移至新的笼子，直到指示的妊娠日为止。
所有样本收集均在09:00至11:00之间进行，没有事先禁食怀孕的大坝。最初使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并在冷氯化钠灌溉溶液（Baxter）中剖析样品，并在液氮中冷冻。将整个胚胎和胎盘用冰冷的乙腈中的橡胶液体均质器手动匀浆：水（80:20）。样品在液氮中闪烁3次，然后在4°C下以16,000g离心10分钟。上清液进行BCA分析，并标准化为70μgml -1，并放置在LC -MS小瓶中。代谢产物分析使用了与先前执行的征服的UHPLC与热科学QECACTICATIVE HF-X杂交四极型高分辨率高分光质谱仪（HRMS）相结合的31。从所有单个样品的相等混合物中生成合并样品，并使用单个正极和负极光谱法DDHRMS/MS采集方法进行高信任代谢物ID进行分析。代谢产物的身份以三种方式证实：（1）在化学公式预测的理论质量5 ppm之内，前体M/Z匹配；（2）片段离子光谱在5 ppm的耐受性与已知代谢物片段的耐受性匹配；（3）代谢物的保留时间在具有相同色谱法纯化标准运行的保留时间的5％以内。使用Sciex Analyst V1.6.3和Thermo Scientific Xcalibur 4.1.50收集LC-MS/MS数据，并使用SCIEX Multiquant v2.1.1和Thermo Scientific Trace Finder v5.1分析了数据。通过在5 ppm公差内搜索的前体离子的色谱峰面积，然后归一化为总离子计数（TIC）来确定相对代谢物的丰度。使用metaboanalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca）进行PCA图，热图，差异丰度和MSOA的统计分析。在分析之前，对数据进行了对数转换和自动尺度。使用GraphPad Prism 9.0.1生成了其他热图（图1E，扩展数据图2E）。对于13C研究，使用自定义的R脚本校正了观察到的质量同位素分布的天然同位素丰度，该脚本可以在GitHub存储库（https://github.com/wencgu/nac）上找到。该脚本是通过调整Accucor算法V0.2.432来编写的。
所有输注都发生在09:00至11:00之间，没有事先禁食怀孕的大坝。最初使用氯胺酮和撒苯嗪（分别为120 mg kg -1和16 mg kg -1，腹膜内）进行麻醉，并在麻醉下使用随后剂量的氯胺酮（20 mg kg -kg -1，腹膜内）维持。将导管（25号）插入尾静脉中，同位素输注后立即开始抽血以标记时间为零。在葡萄糖输注中，总剂量为2.48 g kg -1溶解在750μl正常盐水中，并用62.5μlmin -1的推注施用1分钟，然后输注速率为2.5μlmin -1 -1。在整个输注过程中，抽取恢复的轨道血液抽血，以监测孕产妇血液中的示踪剂富集。谷氨酰胺输注液的总剂量为1.73 g kg -1，溶解在1,500μl正常盐水中，作为推注为147μlmin -1的推注1分钟，然后输注速率为3μlmin -1 -1。在输注结束时将小鼠安乐死，然后去除子宫，并在冷氯化钠灌溉溶液中剖析并在液氮中冷冻。在输注过程中采取了注意，以不增加灌注前水平的营养浓度。
对于连续的剖腹切片，输注参数与上述有关以下变化的相同：（1）连续的剖腹产输注不包括推注；（2）为了获得足够的标记，输注速率增加到5μlmin -1。尽管连续剖析的数据模式与我们在4小时输注液中观察到的数据相匹配，但总体标记略低，因此我们没有将序列化剖腹产数据与较长输注的数据进行比较。尾静脉插管和恢复轨道血液以零为零后，用小切口打开了孕妇大坝的下腹部。将子宫从腹膜腔中取出，将最接近一个卵巢的概念从子宫中剖析，然后进一步解剖为胎盘，并在冷氯化钠灌溉溶液中，然后在液氮中冷冻。将腹膜腔用氯化钠灌溉溶液冲洗，并用纱布覆盖，并在整个手术的其余部分中定期用灌溉溶液冲洗。开始输注，并在指定的时间点以类似的方式进行了单个概念，直到解剖所有胚胎或达到3小时的时间点。
气相色谱 - 质谱法（GCM）用于鉴定葡萄糖，丙酮酸，乳酸，柠檬酸盐，琥珀酸酯，苹果酸盐和天冬氨酸。还使用液相色谱 - 质谱法（LC -MS）鉴定了这些代谢产物，富集值相似。在输注过程中获得的血液样本在冰上冷却5-10分钟，然后在液氮中闪烁。将10–20μl的等分试样添加到80:20乙腈：提取水。将冷冻的组织（整个胚胎和整个胎盘）添加到80:20乙腈：水中并提取以分析13C富集。使用橡胶摇摆匀浆器手动破坏样品，并受到三个冷冻 - 丝自行车的约束，然后以16,000克离心15分钟以沉淀大分子。对于GCMS，将1μLD27-矩流添加为内部对照，将上清液蒸发，然后在30μl无水吡啶中重新悬浮，并用10 mg ML-1甲氧胺吡啶并在室温下孵育过夜。第二天早晨，将样品在70°C孵育10-15分钟，然后以16,000g离心10分钟。将上清液转移到预先准备的GC/MS自动注射器小瓶中，其中含有70μLN-（TERT叔丁基甲基甲硅烷基）-N-甲基三氟乙酰氨酰胺（MTBSTFA）衍生试剂。将样品在70°C下孵育1小时，然后注入1μL的等分试样进行分析。分别使用Agilent 6890或7890气相色谱分析样品，分别与Agilent 5973N或5975C质量选择性检测器进行分析。收集GC -MS数据并使用安捷伦化学E02.02.1431收集和分析。使用自定义的R脚本校正了观察到的质量同位素分布，以校正天然同位素丰度，该脚本可以在GitHub存储库（https://github.com/wencgu/nac）上找到。该脚本是通过调整Accucor算法V0.2.432来编写的。
使用Trizol试剂（Thermo Fisher ScientificCat。No。15596026）从胎盘组织中提取总RNA。根据制造商的说明，使用Taqman逆转录试剂（Thero ScientificCat。No。N8080234），将RNA（3,250 ng）用作70μlcDNA合成反应的模板。将cDNA在无核酸酶的水中稀释1：1，并在384孔板中以4μl的最终体积铺板。胎盘标记物的引物如所述33，并将其稀释至2.5 µm的最终浓度。将引物与Itaq通用SYBR SuperMix（Bio-Rad Cat。编号1725121）混合，并以6μl的体积为6μl，总反应体积为10μl。使用以下方案在Bio-Rad CFX384触摸实时PCR检测机中运行板：（1）聚合酶激活：95°C保持30分钟；（2）PCR相，40个周期：95°C保持5 s，60°C保持30 s；（3）融化曲线，仪器默认设置。如所述，使用∆ΔCT方法计算相对倍数诱导。
从编码鼠标开发Matrix35（https://www.encodeproject.org/）下载了胚胎RNA测序数据。从GD10.5-GD12.5的胎儿心脏，前脑和肝脏获得了Polya Plus RNA-Seq数据（肝脏不全天）。Placenta RNA transcript abundance was obtained from GEO accession code GSE100053 using the GEOquery package36 (https://doi.org/10.18129/B9.bioc.GEOquery) v2.62.1 from BioConductor release (3.14) (https://www.bioconductor.org/).基于已知的代谢基因37,38,39过滤数据，并由京都百科全书和基因组途径的京都百科全书对metaboAnalyst_kegg R软件包（https://github.com/github.com/xia-/xia-lab/metaboanalystr）进行了分类。人与小鼠基因映射基于同源数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）。
将整个胚胎从GD10.5前小鼠中收集到1×PBS中，并使用一次性杵（VWR）机械破坏，然后通过40 µm的细胞过滤器过滤以去除团块。在冰上进行20分钟的抗体染色，然后用HBSS（Invitrogen）洗涤200克（Invitrogen），并在200克离心5分钟。用直接偶联的抗体对小鼠CD71（FITC-R17.217.1.4 Biolegend，1：100），小鼠TER119（APC-TER119 TONBO，1：100），鼠标CD41（PE/CY7-MWREG30 BIOLEGEND，1：1：1：1：1：100）和鼠标CD117（Ckit-apc-apc-apc-apc-efor，将细胞染色。所有细胞均被门控为前部和侧面散射，并基于DAPI（1μgml-1; Sigma，Eflour-450a）的活细胞门控。红细胞是CD117（C-KIT）阴性的细胞，CD71和Ter119为阳性。CD71和TER119为髓样肉眼祖细胞为阴性，CD41和CD117（C-KIT）为阳性。在LSRFortessa细胞分析仪（Becton Dickinson）上检查细胞，并使用BD FACSDIVA 8.0和FlowJO V10生成数字。
在所需发育阶段，怀孕的女性通过二氧化碳窒息安乐死，并去除子宫和胚胎外组织。蛋黄囊用于基因分型，并计数节点。在25°C或4°C过夜，将胚胎固定在4％多聚甲醛中1小时。将固定的胚胎用1×PBS洗涤至少3次，并通过一系列甲醇或乙醇（25％，50％，50％，75％和100％，两次，两次）脱水，使用1％Triton X-100（Fisher Bioreeeeagents，Cat。No。Bp151-100）在1.5-2 no cast（case）中使用1％Triton X-100（Fisher Bioreagents，Cat。No。Bp151-100），然后使用25°C cac，然后bloves cat（bock）。008120）持续2小时。Embryos were incubated in primary antibodies diluted in CAS Block overnight at 4 °C: Rat-anti-PECAM1 (1:100, BD, Biosciences, cat. no. 553370), Rat-anti-endomucin (1:100, Santa Cruz, sc-65495) and Rabbit-anti-connexin 40 (1:100, Alpha Diagnostics International, cat. no.CX-40A）。用1×PBS洗涤胚胎，然后用在4°C的1：250在1：250在CAS块中稀释的继发抗体孵育：驴-Anti-rat 488（Invitrogen，Cat。A21208），Donkey-Anti-Anti-Rabbit 555（Invitrogen，Cat。No。A31572）。将胚胎在1×PBS中洗涤，然后通过甲醇系列（25％，50％，75％，75％，100％两次，每个10分钟）脱水至100％甲醇，在1：2苄醇中清除：苄基苯甲酸苯甲酸苯甲酸酯（BABB）溶液，并在5 mm厚的显微镜Slips and Compopy Slips and Chorp slbb中安装在BABB中（均封装）（均为Charp Biosciencess and rb slb slbbiosciences and rb 110 rb 110 rb16710 rb11710 rb 110 rb 110 rb 110 rb slbb。使用Carl Zeiss Zen 2011软件使用LSM700 Ziess共聚焦显微镜获得图像。如果需要解剖的心脏图像，将整个胚胎通过甲醇系列重新水化为PBS，将心脏解剖并将其放置在1.5 mm 2孔凹凹跃中（电子显微镜科学，CAT。71878-03），其中包含PBS。使用Ziess Images M2获得了全心图像，该图像M2带有AxioCam 506单声道摄像机，该摄像头与Carl Zeiss Zen 2011软件相连。对于截面样品， 将石蜡嵌入的样品在5μM下进行横向切片，并用血久蛋白和曙红染色。
在流式细胞仪，同位素追踪，代谢组学，定量PCR，组织重量，体积计数和组织学实验过程中，对数据进行了分析，以对样品基因型蒙蔽。作为。收集样品，然后将它们传递给A. tasdogan。用于流式细胞仪或I.M.-M。和M.A.C.用于组织学和免疫荧光，以及A. tarangelo。用于定量PCR。作为。处理的样品用于质谱和分析数据。在这些实验中分析了模式后，D。d. dumesnil。前提是基因型信息，因此可以解释结果。对于野生型小鼠的实验，由于A.S.进行了这些实验并分析了数据。对于公开可用数据集的基因表达研究，未进行盲目性。
将小鼠分配给实验，并按任意顺序处理样品，但未使用形式的随机技术。根据统计功率计算，未预先确定样品量，而是基于我们在这些测定方面的经验。对于大多数实验，小鼠的最小数量为3，除了胚胎/胎盘数为n≥10的某些例外。没有数据被排除；但是，有时样本量低于代谢组分析的阈值。在这些情况下，使用了可以从孕产妇或其他组织获得的数据。如果没有样品之一，则在胚胎中与其自身胎盘的直接比较期间未使用这些样品。
在分析群体之间差异的统计显着性之前，我们测试了数据是否正态分布以及组之间的方差是否相似。为了测试正态性，我们进行了shapiro-wilk测试，当3≤n<20或d'Agostino omnibus测试时进行n≥20时进行测试。测试可变异性在组中的可变性显着差异，我们进行了f检验（用于两组实验）或莱文烯的中位数测试（用于两组超过两组的实验）。当数据与正态性或可变性显着偏离时，条件之间有显着差异时，我们将数据转换为数据并再次测试了正态性和可变性。如果转换的数据不再显着偏离正态性和同等变异性，我们对转换数据进行了参数测试。如果无法进行log2转换，或者转换的数据仍然显着偏离正态性或同等变异性，我们对非转化数据进行了非参数测试。
When data or log2-transformed data were normal and equally variable, statistical analyses were performed using Student’s t-tests or paired t-tests (when there were two groups), one-way ANOVAs or repeated measures one-way ANOVAs (when there were more than two groups), two-way repeated measures ANOVAs (when there were two or more groups with multiple metabolites or time points), or mixed effects models (when there were missing values but the data否则，符合单向或双向重复测量方差分析的假设）。当数据或Log2转换数据正常但变化不相等时，使用Welch的t检验（有两组时）或Welch的单向方差分析进行了统计分析，然后进行Dunnett的T3测试，以调整多个镜头的调整（何时有两组）。当数据和Log2转换的数据异常或不等性可变时，使用Mann-Whitney或Wilcoxon匹配的Pairs Pairs签名的等级测试（当两组）或Kruskal-Wallis测试（当比两组不超过两组）。使用Tukey（有两组以上，并且所有比较都具有相关的比较）或Sidak的方法（当ANOVAS或混合效应模型之后有两个以上的组和计划的比较时）对多个比较的P值进行了调整，或者在Kruskal-Wallis测试后进行了邓恩的方法。Holm – Sidak的方法用于调整涉及两个条件之间多个代谢产物的比较。线性回归或非线性曲线拟合方法，即平原，然后是一相关联，用于拟合时间序列数据，并使用额外的方形f检验来评估两个拟合线/曲线之间是否存在差异。使用Holm – Sidak方法调整了多线/曲线拟合P值。使用GraphPad Prism v9.0.1或R 4.0.2进行统计测试。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。