这些研究中使用的印度 - 原始恒河猕猴（Macaca mulatta）在扩展数据中概述了图1C和补充表1。所有实验均均符合各自机构的道德法规（疫苗护理和使用疫苗护理委员会，NIAID，NIAID，NIH和Incortur and Institional Instrutional and Instrutional和Institional Instrutional and Institional and Institional and Institional Instrutional and Institional and Institional Instrutional and Institional Instrutional and Instrutional and Institional and Intersitional的委员会的实验。根据《动物福利法》和实验动物的护理和使用指南，猕猴是根据美国实验动物护理认证协会（AAAALAC）认可的设施中的地方，州，联邦和研究所政策所容纳和照顾的。监测猕猴的身体健康，食物消耗，体重，温度，完整的血液计数和血清化学。所有感染均在匹兹堡大学进行，那里的动物被安置在生物安全3级设施中。
这项研究的样本量使用细菌负担（以log10转换的总胸腔CFU衡量）确定为主要结果变量。最初，我们计划通过比较IV，AE和AE/ID路由与怠速疫苗接种来测试BCG路线功效，并发现每组十个猕猴足以获得超过90％的功率并调整了三个组比较的I型错误率（α= 0.0167）。在这项研究中开始了NHP的第一个队列后，我们选择通过添加IDHIGH组（n = 8猕猴）来测试剂量对ID疫苗接种的影响。额外的治疗组并未大大降低研究的能力。为了检测汇总标准偏差为0.8（使用先前数据）的Log10（总CFU）的1.5差异，我们使用每组10个猕猴获得了90％（90.7％）的功率，该功率具有4个组比较的I型I型错误率（α= 0.0125）。在IDHIGH（n = 8猕猴）和IDLOW（n = 10猕猴）组之间进行的比较，达到了85.6％的功率，检测到相同的差异（Log10（1.5）），并且α= 0.0125。
对于MTB挑战研究（队列1-3），基于性别，体重和疫苗接种前CD4 T细胞对BAL中PPD的反应，将3-5岁的男性（n = 32）和女性（n = 20）猕猴随机分为实验组。如图1C所述，在镇静和连续的队列中在Bioqual，Inc。接种了猕猴。BCG丹麦菌株1331（丹麦哥本哈根Statens Serum Institute）进行了扩展42，在单使用等分试样以大约3×108 cfus ml-1冷冻，并存储在-80°C下。在注射之前，将BCG（对于所有疫苗路线）在含有0.05％Tyboxapol（Sigma-Aldrich）和0.002％抗fifoam Y-30（Sigma-Aldrich）的冷PB中解冻和稀释，以防止BCG的BCG和泡沫化合物在空气化过程中的堆积。对于ID疫苗接种，将BCG注入左上臂（5×105 CFU； idlow）或在每个位置的100-200μl的体积中分裂在两个上臂（5×107 CFU； IDHIGH）中。将IV BCG（5×107 CFU）注射到左隐静脉中，体积为2 ml；如前所述28，AE BCG（5×107 cfus）通过附着在2 mL体积的体积中以2 mL的体积传递，该小儿掩膜附着在Pari Eflow雾化器（Pari Pharma GMGH）上，该烟丝（Pari Pharma gmgh）将4μm颗粒输送到肺中，如前所述28；AE/ID猕猴同时免疫（5×107 CFUS AE加上左臂5×105 CFUS ID）；EB BCG（仅在2 ml中为5×107 CFU；同类6）使用内窥镜灌输到左肺裂片中。气化后未观察到BCG的生存力丧失。在试点研究中，如上所述制备较低剂量的BCG并交付。文本是指标称BCG剂量 - 在疫苗接种后立即对每个队列中的疫苗方案实现BCG CFU，并在扩展数据中进行了报告。图1C和补充表1。
猕猴（队列1-3）在BCG疫苗接种后6-10个月内通过支气管镜用4-36个CFU的BAR编码MTB ERDMAN（扩展数据图1C和补充表1），如前所述，如前所述44。在此范围内的传染性剂量导致该研究和先前的研究中未接种恒河类的结核病疾病水平相似（补充数据12）。临床监测包括定期监测食欲，行为和活动，体重，红细胞沉积率，MTB的胃抽吸和咳嗽生长。这些迹象以及PET-CT特征被用作确定猕猴是否在预定的研究终点之前符合人道终点的标准。
如先前所述的27,45,45,46,47，使用Micropet Focus 220临床前PET扫描仪（Siemens Molecular Solutions）和临床八片螺旋螺旋CT扫描仪（Neurologica Corporation）进行PET-CT扫描。2-脱氧-2-（18F）氟脱氧葡萄糖（FDG）用作PET探针。在MTB之后的4和8周之前，在尸检之前（1-3）或BCG后2和4周进行串行扫描（COLORTS 5A，B）。如上所述47，Osirix MD（V.10.0.1）是图像查看器的DICOM（数字成像和通信）图像查看器进行了扫描分析。测量肺部炎症是肺内的总FDG活性。对感兴趣的区域（ROI）进行了分段，该区域涵盖了CT上的所有肺组织，然后转移到共注册的PET扫描中。在PET扫描中，分离出FDG抗原病理学（标准摄取值> 2.3）的所有图像体素，并汇总，导致累积标准化的吸收值。为了考虑基础代谢FDG摄取，将总FDG活性标准化为静止肌肉，从而导致总肺部炎症值。在每个CT扫描上计数单个颗粒。如果肉芽瘤太小，并且在特定区域内有很多单独计数，或者它们合并，则认为定量数量太多而无法计数。为了测量脾脏的体积，绘制了ROI，在CT扫描的每个轴向切片上概述了整个器官，并在这些ROI上计算了体积（使用Osirix中的工具）计算了体积。从该分析中排除了整个脾可见性受到限制（n = 2猕猴）的任何扫描。
对于挑战研究（队列1-3），NHP在MTB后11-15周或通过戊巴比妥钠注射在人道端点进行安乐死，然后进行病理学检查。已发布的评分System27用于确定每个肺叶（病变的数量和大小），LN（坏死的大小和程度）和肺外隔室（病变的数量和大小）。将所有肉芽肿和其他肺病理，所有胸腔LN和外周LN匹配到最终的PET -CT扫描，并收集以定量MTB。肺中的每个病变（包括肉芽肿，固结和颗粒簇），所有胸腔LN，7个肺叶中的每一个，3-5个肉芽肿（如果存在）或随机样本（30％）或spleen和liver的每个病理学，以及其他病理的量化，则进行了量化。将悬浮液铺在7H11琼脂（DIFCO）上，并在37°C与5％CO2孵育3周，以进行CFU枚举或福尔马林固定和石蜡装置进行组织学检查。对CFU进行计数并求和，以计算猕猴17,27,48的总胸细菌负担。补充表1列出了每个受到挑战的猕猴的MTB CFU。
为了确定BCG CFU，BAL，骨髓抽吸物和血液是从安乐死之前从NHP中收集的。切除了单个肺裂片，胸腔和周围LN，脾脏，肝脏和注射的皮肤部位（如果适用）。将0.5 mL的血液和骨髓和10％的检索液洗涤液铺平；使用GentleMacs Discocator（Miltenyi Biotec）在水中（Miltenyi Biotec）在水中处理大约1 g组织（或一个整体LN或皮肤活检）。将样品铺板并计算为上述。据报道，数据是血液或骨髓的CFU ML -1，每块BAL收集的CFU，CFU每一个LN或皮肤活检，CFU，每肺叶或脾脏。每个NHP的平均肺叶和同一类别的LNS（例如，Hilar）的CFU。
使用Ficoll-Paque Plus梯度分离（GE Healthcare Biosciences）和标准程序分离血液PBMC；如所述，在计数前将BAL洗涤液（PBS 3×20 mL洗涤）在计数前合并，如所述28。通过机械破坏LN并通过70μm细胞滤网过滤。使用Gentlemacs C管和RPMI 1640（Thermofisher Scientific）中的gentlemacs c管和分离剂处理肺和脾组织。使用Ficoll-Paque进一步分离脾脏单核细胞。使用胶原酶，I型（热泡科学）和DNase（Sigma-Aldrich）在37°C下进行30-45分钟，然后摇动，然后通过细胞过滤器，将肺组织消化30-45分钟。将单细胞悬浮液重悬于温暖的R10（RPMI 1640中，含2 mM-谷氨酰胺，100 U ML-1青霉素，100μgml-1链霉素和10％热灭活的FBS；大西洋生物学）或在含有10％DMSO的FBS中保存的液体NitorNitorNitrogen中的FBS或冷冻保存。
通常，在研究结束时从冷冻保存样品中对抗原特异性T细胞反应或细胞组成进行纵向PBMC样品，而对冷冻保存样品进行了分析，而BAL和组织（死亡尸体）样品则分析了新鲜的。如所述，在刺激前将冷冻保存的PBMC洗涤，解冻并在R10中休息过夜，如所述28。对于T细胞刺激测定，将1-50万个活细胞铺在R10中的96孔V底板（Corning）中，单独与R10孵育（背景），或与20μgml-1-1结核蛋白PPD（Statens Serum Institut，丹麦，丹麦，丹麦），20μgml-ML-1 H37RV MLV MLV MLV MT（statens serum Instut），或者ESAT-6和CFP-10肽池（由MD Rockville提供）2小时，然后加入10μgml-1 Bd Golgiplug（BD Biosciences）。优化了PPD和WCL的浓度以检测CD4 T细胞反应。但是，蛋白质抗原刺激可能低估了CD8 T细胞反应。出于后勤原因，在细胞内细胞因子染色之前刺激细胞过夜（总计14小时）。为了确定细胞组成，在加工或解冻后立即在体内染色。补充数据8-11中列出了每个流式细胞仪面板的抗体和四聚体信息。通常，将细胞染色如下（并非所有步骤都适用于所有面板，所有步骤均在室温下）：用PBS/BSA洗涤两次（0.1％）；与PBS/BSA中的恒河猴MR1 Tetramer49（NIH四聚体核心设施）一起孵育20分钟；用PBS洗涤两次；PBS中的活/死污染20分钟；用PBS/BSA洗涤两次；与人FCR阻断试剂（Miltenyi Biotec）孵育10分钟；在PBS/BSA中与表面标记抗体鸡尾酒一起孵育，其中包含1×亮染色缓冲液（BD Biosciences）20分钟；用PBS/BSA洗涤3次（0.1％）；20分钟的孵育BD细胞纤维/细胞处理溶液（BD Biosciences）；用PERM/WASH缓冲液（BD Biosciences）洗涤两次； 30分钟与细胞内抗体鸡尾酒孵育，含有1×亮度污渍缓冲液Plus的Perm/Wash缓冲液；用PERM/WASH缓冲液洗涤三次。对于KI-67染色，如上所述对表面标记和细胞因子进行染色，然后使用EBISOSCIENCE FOXP3/转录因子染色缓冲液（Thermofisher Scientific）进行核透化，并在套件后染色抗体抗体抗体。在修改的BD LSR II或修改的BD FACSymphony上获取数据，并使用FlowJo软件（V.9.9.6 BD Biosciences）进行分析。可以在补充数据8-11中找到门控策略。图形呈现的所有细胞因子数据都是背景提取的。
BCG疫苗接种一个月后，每个队列中的猕猴（每组n = 2猕猴）接受了静脉注射Alexa Fluor 647偶联的抗CD45抗体（IVCD45;60μgkg-1 kg-1，clone Mb4-6d6，miltenyiiii biotec）5 min。在抗CD45注射作为阴性对照之前，在安乐死作为阳性对照之前收集了血液。NHP在收集组织前接受了全身灌注。如上所述处理组织进行BCG CFU定量和流式细胞术分析。所使用的染色面板如补充数据9所示，而APC偶联抗体的省略。
将嵌入的组织切片脱蜡（100％Xylenes，10分钟； 100％乙醇，5分钟； 70％乙醇，5分钟），在抗原检索缓冲液（1×Tris EDTA，pH 9.0）中煮沸6分钟，并冷却。将切片在室温下在加湿室中的PBS（1％BSA）中阻塞30分钟，然后染色CD3（CD3-12，ABCAM），CD11C（5DD11，Leica）和CD20（Thermo Scientific，RB-9013-PO）在休湿室的4°C下在4°C下染色18 h。在Coplin罐子中用PBS洗涤后，将切片在室温下与偶联的抗兔IgG IgG Alexa Fluor 488（Life Technologies，A21206），抗RAT IgG ALEXA Fluor 546（Invitrogen，A11081）和抗Mouse IGGEALEXA Fluor 647（Jackson）（Jack）孵育1小时。5606-150）。洗涤后，使用DAPI安装介质（Life Technologies）使用延长金抗弹药来涂盖板。在Olympus Fluoview FV1000共聚焦显微镜上成像之前，将载玻片固化18-24小时。对肺切片进行成像，并使用CellProfiLerv2.2.2.0分析每个猕猴的两个随机代表性1 mm2 ROI。通过基于像素强度和像素大小为单个通道定量的模块添加模块，设计了管道，为每种细胞类型和总细胞提供了数值。组织学分析是由兽医病理学家（E.K.）以盲目的方式对所有组织的H＆E染色切片进行的。
在MTB和尸检后的0、4、6和8周，在0、4、6和8周进行IFNγELISPOTS。使用前一天，将96孔板（Millipore Sigma）用40％乙醇水合，用无菌水洗涤，并用抗人/猴IFNγ抗体（15μgml-1，MT126L，MT126L，MABTECH）在4°C下在4°C下用抗人/猴IFNγ抗体（15μgML-1，MT126L，MABTECH）水合进行水合。用HBS洗涤板，并用RPMI用10％的人AB血清在37°C下用5％CO2封闭2小时。将大约200,000个PBMC在补充的RPMI中孵育，其中补充了谷氨酸，HEPES和10％的人AB血清，其中含有2μgml-1 ESAT-6或CFP-10肽池，在37°C下，在37°C下，使用5％CO2，在37°C下孵育40-48 h。培养基分别为阴性（背景）和阳性对照组分别单独或佛波尔12,13- dubutyrate（12.5μgml-1）加离子霉素（37.5μgml-1）。为了开发，将板用PBS洗涤，并在37°C下以5％CO2的形式添加板和生物素化的抗人IFNγ抗体（2.5μgml-1，7-B6-1，Mabtech）。洗涤后，在37°C下以5％的二氧化碳在37°C下加入链霉亲和素 - 甲状腺素过氧化物酶（1：100，mabtech）。根据制造商的说明，使用AEC过氧化物酶（Vector Laboratories，Inc。）染色点，并在ELISPOT板读取器上手动计数。数据报告为来自重复背景井的平均Elispots。汇合斑点的井被描述为太多了，无法计数。
为了在BCG免疫后测量先天细胞因子的产生，对冷冻保存的PBMC进行了分析。细胞解冻并重悬于温暖的R10中。然后，将96孔V底板中的每孔5×105个细胞用5％CO2在37°C下过夜。Cells were resuspended in Trained Immunity Media15 plus H37Rv Mtb whole cell lysate (BEI Resources, 20 μg ml−1), heat-killed Staphylococcus aureus (InvivoGen, 1 × 106 per ml), Escherichia coli LPS (Sigma-Aldrich, 1 ng ml−1), or RPMI and incubated for 24 h at 37 °C在收集上清液之前，有5％的二氧化碳。每个说明使用Milliplex NHP细胞因子多路复用试剂盒（Millipore Sigma）确定细胞因子和趋化因子测量结果，并在Bio-Plex Magpix多重读取器（Bio-Rad）上进行分析。
在血浆和十倍浓缩的BAL液中评估了MTB H37RV WCl的IgG，IgA和IgM滴度。与PPD，培养滤液蛋白或脂肪芳族瘤相比，使用了WCL。将96孔Maxisorp Elisa板（NUNC）用0.1μg的WCl涂层过夜。用PBS/FBS（10％）在室温下用PBS/FBS（10％）阻塞板，并用PBS/Tween 20（0.05％）洗涤。1：5在37°C下孵育2小时，串行稀释的血浆或浓缩的BAL液（每个样品8稀释液），然后洗涤。然后，100μl山羊抗孔基HRP偶联的IgG H+L（50 ng ml-1;贝特基实验室，Inc。），IgAα链（0.1μgml-1，Rockland Immunochemicals Inc.）或IgMα链（0.4μgMl-ML-1，sera carey ast at AT AT AT），均为2 H. AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AIN（IgMα链）或IgMα链。将Ultra TMB底物（100μL； Invitrogen）添加12分钟，然后再加入100μL2N硫酸。Data were collected on a Spectramax i3X microplate reader (Molecular Devices) at 450 nm using Softmax Pro and presented either as endpoint titer (reciprocal of last dilution with an OD above the limit of detection or 2× the OD of an empty well) at 0.2 for IgG and IgA, or midpoint titer for IgM where samples did not titre to a cut off of 0.2.
如前所述24，对从NHP BAL获得的单细胞悬浮液进行了高通量单细胞mRNA测序。将每个样品的大约15,000个可行的细胞直接应用于Seq-Well设备的表面。在BCG之后的每个时间点，每个样品都运行两个阵列 - 一个未刺激，一夜之间用20μgml -1的PPD刺激R10。
所有样品的测序均在Illumina Nova-Seq上进行。如先前所述的224,51，使用star50将读数与M. Mulatta基因组对齐，然后使用Dropseq Tools v.1通过Dropseq Tools v.1将对齐的读数通过细胞条形码和唯一的分子标识符（UMI）序列折叠。为了说明潜在的索引交换，我们合并了来自同一测序运行的所有细胞条形码，该条形图在1次限制距离内。
对于每个阵列，我们通过检查每个单元的读取，基因和转录本的分布来评估构建库的质量。对于每个时间点，我们接下来执行降低尺寸降低（PCA）和聚类，如前所述52,53。我们使用UMAP54在二维空间中可视化结果，并根据高表达基因的身份注释每个群集。为了进一步表征细胞类型（例如T细胞）中的子结构，我们如前所述进行了尺寸降低（PCA）并在这些细胞上进行聚类，如前所述24。然后，我们使用T-分布的随机邻居嵌入（T-SNE）24在二维空间中可视化结果。通过与策划的基因列表和在线数据库（即Savant andGsea/MSIGDB）55,56,57，交叉引用定义基因和在线数据库（即CD4和CD8 T细胞）进一步注释簇（即CD4和CD8 T细胞）。
如前所述24，在显着的主要成分上，在第13周或25周的受刺激或未刺激的T细胞的数据是亚组，对于那些主要成分，在通过随机方法（“ jackstraw”）确定的具有明显负载的基因上，52。然后将这些矩阵用作WGCNA58的输入。遵循WGCNA教程（https://horvath.genetics.ucla.edu/html/coexpressionnetwork/rpackages/wgcna/tutorials/），我们选择了适当的软功率阈值来计算邻接矩阵。随着SCRNA-SEQ数据受转录物辍学的影响（失败的捕获事件），具有高功率的邻接矩阵进一步膨胀了该技术限制的效果，并且很少产生相关模块。因此，在可能的情况下，我们选择了WGCNA的作者所建议的力量（即，第一个自由拓扑高于0.8的功率）；但是，如果这种功率产生的模块很少（少于三个），我们会降低动力。然后，我们使用选定的软功率生成了一个邻接矩阵，并将其转换为拓扑重叠矩阵（TOM）。随后，我们从分层聚集了这个TOM，并使用方法“树”使用了碎屑函数，以使用0.5的差异阈值（即0.5的相关性）来识别相关基因的模块。为了测试每个模块中观察到的相关性的重要性，我们实施了一个排列测试。通过平均基因表达（bin的数量= 10）将基因固定在真实模块中，我们随机选择了基因，其基因从用于模块发现的总基因列表中的平均表达分布相同，10,000次。对于这些随机模块中的每一个，我们在真实模块中基因之间的差异值分布与随机模块中基因之间的分布之间进行了单方面的Mann-Whitney U检验。纠正Benjamini – Hochberg的多个假设检验的产生的P值， 如果少于500个测试，我们认为该模块很重要（P < 0.05) had false discovery rate > 0.05。
为了表征疫苗接种后13周收集的体外刺激的T细胞中鉴定出的七个重要基因模块，我们使用基因表达特征（Savant和GSEA/MSIGDB）的数据库进行了富集分析。具体而言，Savant数据库中的丰富度包括Immgen，Mouse Body Atlas和其他数据集的签名（http://newpathways.mcdb.ucla.edu/savant-dev/），使用在具有32,681个基因的跨单个基因的跨基因中进行的基因进行，使用32,681个基因的基因进行，使用32,681基因的基因（https://varemo.github.io/piano/）。
所有报告的P值均来自双面比较。对于连续变量，使用Kruskal – Wallis测试进行了与Dunn的多重比较调整或Dunnett的单向ANOVA进行比较的疫苗路线，并进行了Dunnett的多重比较调整（将所有路线与IDLOW BCG进行比较）。Fisher的精确测试进行了多个CFU阈值（评估保护），以评估MTB疫苗路线与保护之间的关联（扩展数据图8B）。使用置换测试59将所有疫苗组的分数分布（饼图）与idlow BCG进行比较。对于临床参数，将所有NHP的疫苗接种前测量值与每个疫苗组的分布进行比较。为了评估BAL或PBMC中疫苗接种后抗原反应性CD4或CD8 T细胞是否与疾病的严重程度相关，我们首先在疫苗方案过程中计算了每个NHP的峰值T细胞反应。在BAL内计算了Log10转换的CD4和CD8细胞计数，并在PBMC中计算了CD4和CD8细胞的频率。为了评估疫苗路线和T细胞对Log10转换总CFU的影响，在JMP Pro（V.12.1.0）中运行了多个多个线性回归。补充表1中提供了这些分析中每个猕猴的峰值T细胞反应和CFU；补充表5中提供了详细的回归输出（包括模型拟合，ANOVA结果，效应测试和参数估计）。使用双向ANOVA和DUNNETT的多重比较测试比较了训练有素的免疫测定的细胞因子产生。通过使用Wilcoxon签名的秩检验，分析了IFNγELISPOT对IFNγELISPOT对CFP，ESAT-6或CFP-10的串行PBMC响应，以比较感染前的感染前与感染后12周（在每种疫苗途径内）。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。