如最近一项研究26中所述，制备了ACE2（19-615）（19-615）和稳定的“ 2p”突变体（K986p和V987p），具有完整的FURIN裂解位点的SARS-COV-2 Spike（残基1-1208）。简而言之，蛋白质在3-4和6-7天后在3-4和6-7天后收集两次，并用亲和色谱纯化（使用takara的Conta树脂，ACE2与IBA Lifesciences的ACE2使用Conta Resin，从IBA Lifesciences中使用ACE2），然后从IBA LIFESCIENCES中进行ACE2进行纯化，随后是GEL FILTRATION in 20 mmmmmmmmmmmmm h。如前所述26，然后将纯化的尖峰与外源性脂蛋白（新英格兰Biolabs）一起孵育5小时，然后通过添加EDTA停止反应。

　　R2/2 200-MESH量化的网格在25 mA处发光30 s，以使其冻结。如先前所述的26和45-60 s，在最终陷入网格之前，将液蛋白处理的SARS-COV-2尖峰与辛基糖苷混合在一起，并以1：2的三聚体尖峰的最终摩尔比：ACE2浓缩ACE2，旨在获得0.5 mg ml-gluc的最终浓度，旨在获得0.5 mg ml-gluc的最终浓度。然后，将4μl所获得的反应混合物施加在100％湿度的4°C预校准的网格上，使用Vitrobot Mark III用滤纸涂上4-4.5 s，并在液态乙烷中进行暴发。

　　使用EPU软件在300 kV下运行的Titan Krios显微镜上收集数据。使用安装在Gatan GIF量子量滤波器上的GATAN K2检测器以零损坏模式运行，狭缝宽度为20 eV，收集了显微照片。暴露量为8 s，分数为32帧，累积剂量为54.4 e -Å -2，校准像素尺寸为1.08Å。图像在1.5至3.0μm之间的一系列DeDoci范围内收集。

　　使用Relion32中实现的MotionCor231对齐电影，然后使用CTFFIND433进行对比传递函数（CTF）估计。使用手动训练的模型使用Cryolo34挑选颗粒。使用CryoSparc35对颗粒进行多个二维分类。保留了显示明确的二级结构的类，并将其分成类似于与ACE2结合的S1单体相似的子集。使用CryoSparc中的AB始于重建制作初始模型。如图3所示，通过广泛的三维分类，将包含三聚峰值蛋白的不同种类分离。单体S1 – ACE2复合物分类为扩展数据图4A，并在CryoSparc中使用不均匀的细化进行了完善，并与CTF细化相结合。从S1 – ACE2复合物中的最终粒子进行了未掩盖的细化，以更好地解析有序较低的域，总体较低的全局分辨率（扩展数据图4B，C）。使用CryoSparc中实现的Blocres37估算了局部分辨率。在冷冻PARC中局部过滤地图，并在全球范围内磨砂38（扩展数据图5，6）。

　　单体S1 -ACE2复合物的模型基于先前确定的晶体结构（PDB：6M0J）24，RBD的其他部分和中间域取自封闭的三聚体（PDB：6ZGE）的先前结构26。三聚体结构的模型是使用我们先前的研究26的结构（PDB：6ZGE）和一部分RBD结构（PDB：6ZGG）构建的。该模型的RBD – ACE2部分是使用本研究高分辨率S1 -ACE2复合物中的结构构建的。使用COOT39手动调整模型。S1 – ACE2和一ace2结合的封闭结构的模型得到了完善，并使用Phenix Real Space Refine40进行了验证。使用NAMDINATOR41进行了另一个较低的分辨率模型，并在Phenix中的几何形状最小化和验证（扩展数据表2）。使用CHIMERA42，CCP4MG43和PISA44进行测量，结构在S2的大螺旋上对齐（残基986–1032）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。