与MS的双胞胎队列是MS双胞胎研究的一部分，代表了MS不一致的单卵双胞胎队列，位于德国LMU Klinikum Munich的临床神经免疫学研究所。招聘始于2012年5月，仍在进行；截至2020年5月，本研究中使用的样品已收集。
如果在修订后的麦当劳标准中建立了MS的诊断，则满足研究参与的纳入标准48,49，而双胞胎兄弟姐妹在临床上很健康。排除标准是感染以及在抽样前3个月内用抗生素或高剂量静脉注射糖皮质激素治疗。MS的单卵双胞胎双对（n = 61）在LMU Klinikum Munich的临床神经免疫学研究所访问了门诊科进行了详细的访谈，神经系统检查，血液采样和MRI调查（仅在双胞胎中占据）。为了确认MS的诊断，获得并审查了包括MRI扫描在内的病历（扩展数据表1，补充表1、2）。
由于已知当前的疾病调整治疗对周围免疫签名38具有很强的影响38，我们选择了一个亚组，其中，具有MS的双胞胎在血液采样时未接受治疗（n = 20）以进行进一步分析（扩展数据表1，补充表1，补充表1，2）。扩展的残疾状态量表（EDSS）用作MS50双胞胎的疾病严重程度的量度。
MS Twin研究得到了慕尼黑路德维希 - 马克西米利人 - 澳大利亚大学的地方伦理委员会的批准（伦理批准项目编号267-13）。所有参与者都根据赫尔辛基宣言的原则予以书面知情同意。
在含EDTA的管中收集了MS双胞胎研究的研究参与者的血液样本。为了排除样品收集偏见，在饭前和同一天，从每对双胞胎对中抽取血液样本。如前所述，通过使用淋巴结液（Stemcell Technologies）离心密度梯度梯度离心，并使用无血清冷冻保存培养基（CTL-CRYO ABC培养基试剂盒，免疫子弹）在液氮中分离PBMC，并在1×107细胞中进行冷冻保存。
为了测量来自与MS的双胞胎队列的PBMC的细胞因子表达，如先前所述51，以抗原独立的方式激活了25个双胞胎（19对处理对和6个未处理的对）的细胞（19对和6个未处理的对）。简而言之，白细胞从液氮储存中取走，并在37°C的水浴中融化。将细胞恢复在细胞培养基（RPMI-1640，10％FCS（Biochrom），1× - 谷氨酰胺和1×青霉素 - 链霉素（两个生命技术））中，并补充了1：10,000苯甲酶（Sigma-Aldrich），然后在350米中进行培养（350分钟），并在350分中进行培养。随后将样品进行了用于质量细胞仪的抗体标记，或者在细胞内细胞因子检测的情况下，在37°C和5％CO2中孵育过夜，然后用50 ng ml-1 phorbol 12-菲尔伯12-丙酸13-乙酸盐（Sigma-aldrich）（Sigma-Aldrich）和500 ng-ML-1 Ionmycin（Sigman insy Insymcin（Sigma-1）Ionmycin（Sigma-1 Ionmycin）（Sigma-1 Inconmcin）（Sigma-1 ionmycin）1×Brefeldin A和1×Monensin（均为BD Biosciences）在37°C下持续4小时。如下所述，细胞进行了表面标记抗体标记，固定，透化和细胞内细胞因子抗体标记。
按照制造商的指示，购买了已经重量缀合的抗体，要么使用MaxPar X8螯合聚合物试剂盒（FLUIDIGM）购买已经重量缀合（流体）或在内部共轭的抗体。补充表3中总结了抗体克隆，相应的重金属标签和供应商。购买了Cite-Seq实验中使用的抗体预偶联，并在补充表7中总结了。
为了消除样品处理和数据采集期间的技术变异性，如先前所述，应用了受限制的组合9- choose-3实活条形码策略，如前所述14。To achieve this, anti-CD45 monoclonal antibodies (mAbs; BioLegend) were conjugated using MaxPar X8 polymers (Fluidigm) and palladium (104Pd, 105Pd, 106Pd, 108Pd and 110Pd), indium (113In and 115In; all from Trace Sciences International) and tantalum (181Ta; Sigma)同位素。另外，使用了Y89偶联的抗CD45 mAb（流体）。双对随机分配，并在两批批次进行之前，将带有MS的双胞胎的PBMC在两个独立的质量细胞仪中进行，然后在两批批处理中进行条形码。在样品解冻和/或离体激活细胞后，在37°C下用重金属标记的CD45抗体在细胞标记培养基（CLM; RPMI-1640，4％FCS）的37°C下标记25分钟，在轨道振荡器（500 rpm）上。将条形码样品在CLM中洗涤两次，并将其合并成单反应容器，以进行表面标记和/或细胞因子检测。
条形码后，将样品备量标记在400μlCLM中，其中包含抗体混合物在37°C下在轨道振动振机（500 rpm）上的抗体混合物（补充表3），持续40分钟。在冰上加入顺铂（PBS中的2.5μm），在冰上加入2分钟，以实现活/死细胞歧视，并通过在PBS中添加2％FC来停止反应，并在冰上孵育2分钟。
为了检测转录因子，固定条形码样品备忘录并在1x Foxp3固定/透化缓冲液（Biolegend）中在4°C下40分钟，并在透化缓冲液中洗涤（PBS，0.5％saponin，2％Bovine Serum Cholim Cholim Cholin（Bsa）和0.001％）和0.001％SODDRHIM SODRICH（BSA）。在400μl透化缓冲液中进行标记，该缓冲液在4°C下含有抗体混合物1 h。
在细胞内细胞因子检测的情况下，将样品备忘录固定在1.6％多聚甲醛（电子显微镜科学）中，在4°C下固定1小时，并用透化缓冲液洗涤。样品用抗体标记，识别400μl透化缓冲液在4°C下的细胞内细胞因子1 h。
对于表面和核抗原检测和细胞内细胞因子检测，将标记的样品备忘录洗涤并在4°C下在1倍虹膜介导剂溶液（Fluidigm）中孵育过夜。用PBS两次洗涤样品，并用Maxpar水（流体）两次洗涤，并获取以下数据。
通过每天的仪器质量控制和调整，在Cytof 2.1质量细胞仪（流体）上获取数据。使用五元素珠（Fluidigigm）52将两个独立的cytof运行中的采集（每个都包含两个双胞胎兄弟姐妹）进行了归一化。为了监视潜在的批处理效应，每次独立运行都包含两个在两个运行中存在的归一化对照样本。使用FlowJo（Treestar）手动门控，根据事件长度，中心，宽度，DNA（191IR和193IR）和Live/Dead（195pT）通道来识别样品中的活细胞。此后，通过利用专门带有三个条形码的细胞的布尔门来删除样品，以防止条形码错误识别并促进Doublet排除。使用不同的辅助因子的逆双曲线正弦（Arcsine）功能在R环境中转换质量细胞仪数据，以说明单个标记之间的标记变异性。为了消除两个独立的质量细胞仪之间的残留批次效应，通过修改Arcsine cofactor来对齐样品的单个标记，以达到两种归一化对照的标记强度时达到相同的平均值。使用转换后的数据集的第99.9个百分位数应用了基于标记的百分位数归一化。类似地，通过使用未刺激的对照来计算残留细胞因子强度的第99个百分位数来确定单个细胞因子阳性。
整个分析是在RSTUDIO和Visual Studio Code（Microsoft）的统计编程环境R中进行的。使用带有默认参数的UMAP软件包计算UMAP。53。对于参考框架的生成，以与先前描述的51,55相似的方式应用流量54。简而言之，生成了100个组合数据集的簇，并根据ComesenSusususususususustlustlus软件包确定的肘标准执行元群集。根据单个元群和UMAP上定位的中位表达曲线手动合并和注释所得的元簇。在初始聚类产生的主要种群（例如CD4+ T细胞），CD8+ T细胞，B细胞和髓样细胞等主要种群之后，将每个主要种群迭代地聚类为描绘参考框架节点的亚群。
使用DiffCyt软件包56进行了数据驱动分析。为此，将标记分离为细胞状态和细胞类型标记（补充表3），并使用配对设计的设计矩阵进行了差异状态差异分析。使用Benjamini – Hochberg Awse57，使用中调节的Limma-trend方法提取了所有具有MS的双胞胎和未受影响的双胞胎兄弟姐妹之间的显着免疫特征，并采用了错误的发现校正。为了排除治疗诱导的免疫改变，使用第二个过滤器来鉴定仅具有MS的未经处理的双胞胎与未受影响的双胞胎兄弟姐妹之间的显着免疫特征。因此，提取了满足这两种条件的免疫特征：（1）在所有具有MS和未受影响的双胞胎兄弟姐妹的双胞胎之间，它们似乎显着差异，并且（2）并未通过使用MS的双胞胎进行疾病修改治疗来引起（2）。
使用grappolo的修改和脚手架框架的Vite套件生成了网络可视化以将DiffCyt生成的簇映射到参考框架上，或绘制不同的质量细胞仪面板，Infinity Flow Data或Cite-Seq数据。使用Fruchterman – Reingold和Kamada-Kawai算法重新排列了由IGRAPH软件包中实现的，并使用Ggraph进行了修改和可视化。使用Pheatmap包装绘制热图。使用HMISC和Corrplot软件包生成相关图。使用GGPLOT2绘制所有其余图。
为了添加差异状态吞噬细胞节点，使用包含14个骨干标记和332个预测标记的健康PBMC的Infinity Flow数据生成了扩展的髓样参考框架。24。为了生成扩展的髓样参考节点，如上所述，使用骨干标记来应用流量聚类。InfinityFlow数据集包含32个标记的重叠，其中具有MS的质量细胞仪数据集，其中促进了使用grappolo和vite packages在扩展参考节点上绘制diffcyt-差异状态节点的映射。
Frozen PBMC samples from eight twin pairs with MS (16 samples; four pairs analysed by both CyTOF and CITE-seq and four additional pairs exclusively by CITE-seq) plus two additional healthy samples (total of 18 samples) were thawed quickly and washed twice with 1% BSA in PBS at 4 °C, followed by centrifugation at 300g for 10 min.将PBMC颗粒用人信任FCX FC FC试剂（Biolegend）染色10分钟，并用可固定的可行性染料APC-EFLUOR 780，抗CD3-AF700（Cli-CD3-AF700（Clone okt3，Invitrogen），抗CD4-PACICIFIC BLUE（Cli1-buone buone s3.5，Invit，anti-c1111），进一步染色。在冰上生物预种）和TotalSeq-C-C抗体（补充表7）30分钟。CD4+ T细胞在Facsaria Fusion（BD）上被纯化为单重，Live，CD3+和CD4+。同时，将第二个人口分为单重，现场，CD3-和CD11C+。
在PBS中将分类的细胞在0.04％BSA中洗涤。每个样品的每个样品大约25,000个细胞在10倍芯片上加载，并使用铬NextGem单细胞V（d）J试剂盒v1.1 v1.1与特征条形码蛋白（10x基因组）的特征条形码技术一起运行到10倍铬控制器上。使用单个铬I7样品指数将基因表达，TCR富集和细胞表面蛋白表达多路复用。使用150 bp配对末端读数和8 bp的i7指数对基因表达和TCR富集库进行了测序，旨在每个细胞的基因表达50,000个读取，每个细胞的读数为5,000个细胞读取，以供TCR富集进行5,000个读取。使用50 bp配对末端读数和8 bp的i7索引在Novaseq S1流圈上对细胞表面蛋白表达式文库进行了测序，旨在每个单元格10,000个读取。
细胞游骑兵软件（10倍基因组学，v.6.1）用于删除样品，处理原始数据，对齐读取grch38人类参考基因组，并总结唯一的分子标识符（UMI）计数。过滤的基因 - 巴尔科代码和细胞表面蛋白表达 - 核能矩阵仅包含经过细胞检测阈值的条形码的条形码，用于进一步分析。然后，我们使用R软件包Seurat（版本4.0.3）59处理了过滤后的UMI计数矩阵。从计数矩阵中除去了少于500个基因和/或> 15％的线粒体读数的细胞，并且在少于三个细胞中表达的基因被从计数矩阵中取出。在质量控制之后，仅将高质量单元中的原始基因计数提交为：对数差异化；使用VST方法鉴定高变量基因；缩放；和针对每个细胞UMIS和线粒体RNA含量的回归。我们应用了k-nearest邻居的无偏计算，生成了邻域图并使用UMAP嵌入。使用Findallmarkers函数计算每个簇和所有其他细胞之间的差异表达基因。使用UMAP可视化对每个群集的上调基因的组合手动策划Seurat簇的注释。
初始群集注释后，我们将所有包含髓样细胞的簇子集并重新分析了该子集。子集后，进行了使用相互主成分分析的集成以消除批处理效应，并将集成测定用于主成分分析和无监督的聚类。使用规范蛋白和mRNA标记的组合对Seurat子截面进行注释。与髓样细胞相似，仅检测到TCR克隆型的CD4+ T细胞被子和重新分析。使用Cell Ranger VDJ管道（10x Genomics，v.6.1），从TCR富集测序数据中计算单细胞TCR。去除包含两个以上β链的CD4+ T细胞。
仅使用具有MS兄弟姐妹和未受影响的兄弟姐妹的数据的样品进行下游分析：分别用于髓样和TH细胞群体的七对和八个双子。
使用Twinship作为潜在变量，使用Logistic回归模型计算了受MS影响和未受影响的双胞胎兄弟姐妹之间差异表达的基因。通过对每个表面标记获得的原始计数的Arcsine转换，将CITE-SEQ数据映射到质量细胞仪数据上，然后将百分比归一化的原始计数与质量细胞仪数据相似。如上所述，将所得的转换和归一化数据与质量细胞仪数据结合使用，使用grappolo和Vite软件包创建蜂窝网络。转录因子调节活性是根据其靶标的基因表达水平推断出的。使用Monocle 3（参考文献61）根据相应的UMAP计算轨迹和假频率。随后，使用python62中实现的扫描式分析框架，将Seurat对象转换为.H5AD格式，以进一步进行轨迹分析和扩散图计算。使用MGCV软件包中的广义添加剂模型平滑沿伪频段的表面标记表达。
为了剖析遗传，早期共享的环境和独特的环境差异来源，用于免疫亚群中免疫种群或中位标记表达式的频率，可访问健康的单氮和双卵双胞胎对的公开可用的流式细胞术数据17。在与MS的双胞胎队列中，选择了健康的单卵（n = 21）和双胞胎双对（n = 22）双对与双胞胎对匹配（扩展数据表1）。使用FlowJo（Treestar）校正流式细胞仪数据的补偿矩阵，并使用手动门控在双胞胎队列中与MS中参考框架的免疫子集匹配的种群。将产生的免疫子集频率或中值标记表达式导入到R中。方差成分在使用UMX套件的UMXACE函数中估算了使用默认参数的UMXACE函数的两组Cholesky Twin模型 - 通常应用于Twin Stesuce 63,64的框架。
为了验证双胞胎队列中与MS的研究结果，访问了14个通过质量细胞仪测量的非双线的公开可用的横截面队列14（扩展数据表1）。分析是使用RRMS的专门治疗的患者进行的。公开可用的数据集中提供了每个单元格的主要人群和细胞亚群标签。
使用未配对的非参数Mann – Whitney-Wilcoxon检验比较免疫细胞频率和中值标记表达式，或根据Benjamini-Hochberg近距离校正，在Stats软件包中实现的配对的非参数Wilcoxon签名的 - 签名式测试。对于验证队列，将RRMS和健康供体患者之间的CD25表达的每个患者平均值比较为对异常值敏感的统计参数，因此只能通过NAIVE TH细胞的子集来反映可变的CD25表达。质量细胞仪分析是在两次独立运行中进行的，由于珍贵样品材料有限，因此未重复进行。Cite-seq分析一次。使用logistic回归模型将基因表达，模块得分和转录因子活性在具有Twinship作为潜在变量的逻辑回归模型和未受影响的双胞胎兄弟姐妹之间进行比较，并将每个模型与非可能性比测试的无效模型进行比较并应用bunderferroni校正。使用基本LM函数进行线性回归分析。使用RSTATIX软件包中实现的Wilcoxon两样本配对签名测试来计算二线对效应尺寸。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。