秀丽隐杆线虫动物在20°C的NGM板上使用OP50大肠杆菌作为食物来源根据标准程序进行培养，除非另有说明50。N2 Bristol用作野生型参考菌株。秀丽隐杆线虫转基因菌株是通过对感兴趣的构建（使用1-10 ng µl-1的质粒DNA）进行的，并与选择标记物质粒PODR-1 :: RFP（100 ng µl-1），PODR-1），PODR-1 :::: gfp（100 ng µl-1）或100 ng µl-1）或100 ng-100 ng lf（100 ng µl-1 :: rfp（100 ng µl-1）一起注射。转基因动物。两种构建体用作PVD膜标记：Ser2Prom3 :: Myristoylated :: MCherry在检查荧光蛋白定位和SER2PROM3 :: Myristoylated :: GFP检查神经元的形态时。补充表2中提供了本研究中使用的秀丽隐杆线虫菌株的详细描述。除非另有说明，否则在L4幼虫阶段分析了秀丽隐杆线虫雌雄同体。成像之前，通过将Dynamin-1温度敏感的秀丽隐杆线虫动物转移到限制性温度（32°C）中，获得了Dynamin-1抑制作用。野生型秀丽隐杆线虫动物的生长，处理和成像并联。
所有构建体均在补充表3中描述。在本研究中生成的构造用于秀丽隐杆线虫实验，使用重叠的寡核苷酸51使用等温组装方法创建。Flippase介导的重组用于在有限数量的细胞中实现内源性融合蛋白的选择性标记52。秀丽隐杆线虫表达构建体是在PSM Delta载体中制成的。SER2PROM3 :: FLP是从SER-2的4,141-核苷酸5'启动子序列和2x核定位序列（NLS）FLP重组酶序列中组装的，来自PMLS26253。SER2PROM3 :: NF-186（大鼠）和Ser2Prom3 :: NF-186（FIGQD）（Rat）（大鼠）是从SER-2和3,516-核苷酸大鼠HA – NF-186 sequence25（添加核苷酸元素的4,141-核苷酸5'启动子序列中组装的。通过反向克隆底漆引入FIGQD点突变，以扩大NF-186序列：CCTTTACTCATAGAGCCGCTTCCACTACCCCCCCCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGGCCGGATGATGATGATGATGATGATGAGGATGAGATGGTGGCTGCTGCTCTCTCTCTCTCCTCTCCTCTCTTCTTCTTCTTCTCTTGTGTGTGTGTGCTGTGCCTGCTGCTGCTGCTGCCTGCAGGACGAGTGTGTCCTGCCCTGCCATAAATAAAAGGAGGAGGAGGAGCCCATTCTTCTCTCTC。
内源性荧光团插入，基台的变化或缺失以及嵌合受体是通过CRISPR -CAS9蛋白复合物的性腺显微注射而产生的。使用标准方案54进行CRISPR – CAS9基因组编辑。CAS9蛋白和曲克纳（IDT）均以1.525 µm注射。以1.525 µm的浓度注射CRRNA（IDT）。使用PCR或以Ultramers（IDT）的订购生成DNA修复模板，并以0.15–3 µm注射。DPY-10（CN64）用作共同注射标记，一旦生成所需的基因组编辑，就会过头。使用PCR筛选F2秀丽隐杆线虫动物进行所需的基因组编辑，并通过测序确认。补充表4列出了用于基因组编辑的指南RNA。
在活的秀丽隐杆线虫动物中，在室温下捕获了荧光标记的融合蛋白的图像。使用10 mM levamiso（Sigma-Aldrich）在M9缓冲液中将l4阶段雌雄同体秀丽隐杆线虫动物麻醉，并安装在5％琼脂糖垫上进行成像。C. elegans animals were imaged on either an inverted Zeiss Axio Observer Z1 microscope equipped with a Hamamatsu EM-CCD digital camera, a Yokogawa CSU-X1 spinning-disk unit, controlled by metamorph (version 7.8.12.0), and using either a Plan-Apochromat 100× 1.4 NA objective or a 63× 1.4 NA objective or on an inverted Zeiss Axio ObserverZ1显微镜配备了横川CSU-W1旋转盘单元，由3i SlideBook（V6）控制的Prime 95B Scientific CMOS摄像头，并使用C-Apochromat 40×0.9 Na或63×1.2 Na Objective。使用载体衍射激光扫描仪（3i）在上述显微镜上进行FRAP实验。在所有情况下，图像设置（例如，暴露时间和激光功率）对于整个实验中的所有基因型都是相同的。
使用斐济软件5,56对未经处理的图像进行定量图像分析。旋转，裁剪并拉直以生成显示图像。在斐济调整了亮度和对比度，以显示相关特征，以相同方式对其进行比较。使用斐济产生基因函数。使用斐济中的绘图函数对AIS区域进行了AIS区域的线扫描分析。使用斐济中的COLOC2插件计算了Manders的重叠系数，以量化内源性RAB荧光与AIS中的内源性DMA-1荧光重叠。重叠是通过在AIS周围绘制感兴趣的区域并使用Costes的阈值来计算重叠。使用荧光阈值和自动粒子计数计算点密度，以使用斐济中的标准阈值和粒子分析函数来确定每微米的点数。
为了计算树突极性指数，使用Fiji中的徒手选择函数根据一般的MCHERRY膜标记来追溯PVD的树突或轴突。分别测量了树突（DP）和轴突（AP）中荧光标记的蛋白的平均像素强度，并分别测量树突（DM）和Axon（AM）中的膜结合的MCHERRY。树突（D）或轴突（a）中荧光标记蛋白的归一化平均强度由：d = dp/dm和a = ap/am计算。由于左右PVD轴突区域重叠，我们将货物的GFP信号归一化，但是每个神经元对膜结合的MCHERRY和货物GFP的贡献是成比例的。每个蠕虫的极性指数（PI）由以下方式获得：pi = d/（a+d）。对于完全轴突定位的PI为0，完全树枝状定位为1，非极化定位为0.5。所有的树突极性指数均基于近端树枝状区域计算，尽管与近端枝形状区域相比，没有发现差异。
如前所述57，通过触摸第1天的成年秀丽隐杆线虫动物在人体的中部中带有铂金属丝拾音器，进行了严格的触摸逃逸反应测定法。电线铂齐的尖端被扁平，切割为20毫米厚，宽30毫米。对于每种基因型，对秀丽隐杆线虫动物进行了10次测试10次，试验之间的间隔为10分钟。用于该测定法的所有秀丽隐杆线虫动物均在MEC-4（E1611）轻型突变体背景中，除了用作对照58的MEC-3（E1338）动物外，除了MEC-3（E1338）动物外，还隔离了刺激性的触摸反应。秀丽隐杆线虫在DEGT-1和MEC-3中携带突变的动物，该动物分别编码DEG/ENAC通道和控制触摸受体神经元的分化的同源型转录因子，作为对照动物的对照动物，具有已知行为缺陷为58,59的对照动物。进行这些实验并分析对基因型视而不见。
先前使用了TFR-SEP质粒42和描述60。构造的mscarlet-navii-iiIIII质粒如下：从yfp-navii-iiiii质粒（addgene＃26056）中提取Nav1.2钠通道的片段，pcr（：forffer tagtcgcgcgccgccagcagcagcagcagcagtttctcagcagctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct;用PVUI和XHOI消化并连接到PMSCARLET_ABHD6 VECTOR（来自B. Fakler的礼物）中的cactcgagctagcttattatcttgtgtagcacgtt），在CMV启动器的控制下，MSCARLET -NAVII – III表达。通过测序验证了构建体。
怀孕的Sprague-Dawley大鼠（Janvier Labs）的湿度为50-70％，并随意进食和12小时的浅黑暗周期饲养18-22°C。如前所述，按照银行家方法61培养神经元。42。所有程序均符合《欧洲医疗和使用实验动物的护理指南》，并获得了波尔多大学伦理委员会（CE50）和法国研究部的批准。
单独使用TFR – SEP或与Mscarlet -Navii – III一起在6天的体外（DIV）转染神经元。实时细胞记录在9-10 div进行。神经元在37°C下用HEPES缓冲盐溶液（HBS）灌注。HBS包含（以毫米为单位）：120 NaCl，2 kCl，2 mgcl2，2 Cacl2，5-葡萄糖和10 hepes，并将其调整为pH 7.4和260-270 MOSM。对于脉冲-PH测定，通过用ME代替HEPE并将pH调节为5.5来制备MES缓冲盐溶液（MB）。所有盐均来自Sigma-Aldrich。视野以Mscarlet -Navii – III或内源性神经素荧光可视化，以AI为中心。Endogenous neurofascin was visualized by labelling with anti-Neurofascin antibody diluted in HBS (1:250) (Monoclonal mouse (clone A12/18), Antibodies Incorporated 75-172, RRID AB_2282826) for 10 min and then labelled with anti-mouse Alexa568 (Thermo Fisher Scientific, A10037, RRIDAB_2534013）在HBS（1：500）中持续3分钟。视野还包含SOMA的一部分和一些树突（在21个mscarlet – Navii – III录制中，有17个表达录音中有17个，而在20个神经素标记的20个记录中，有12个用于比较。如先前所述，使用2向硼硅酸盐玻璃移液器在记录的细胞周围局部灌注HBS和MB。使用Olympus IX71倒置显微镜进行成像，该显微镜配备了总内反射荧光显微镜，并具有150×，1.45 Na物镜（UAPON150XOTIRF）（Cobolt Laser Laser 06-DPL 473 nm，100 mW），100 mW）和ILAS2 ILAS2 Illuminator（gataca Systems）upentation（uapon150xotirf）（uapon150xotirf）（gataca inseration）pecteration（gataCa）。用二分镜（R405/488/561/635）和发射过滤器（ET525/50M，色度，色度技术）过滤发射的荧光，并由EM-CCD摄像头（Quantem 512C，Princeton，Princeton Instruments）记录，由metamorph（版本7.10.3.279）控制。在0.5 Hz以0.5 Hz获取视频10分钟。
使用先前描述的定制MATLAB脚本40,42进行了内吞事件及其分析的检测。简而言之，在pH 5.5图像中出现突然的点状荧光增加被检测为一个内吞事件，如果：（1）可见3帧以上（即8 s），并且（2）在pH 7.4图像中可检测到的前静态荧光群集在相同的位置。如前所述，使用训练有素的支持向量机对每个单元的候选事件进行验证。事件频率是在AI，选定的树突或整个神经元周围绘制的细胞口罩上测量的每个细胞表面积表示的事件频率。
对于免疫细胞化学，将细胞固定在温暖的4％多聚甲醛/4％蔗糖中的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中。用PBS冲洗后，将细胞用0.1％Triton X-100在含有1％明胶（PGT缓冲液）（阻断非特异性结合）的PBS中透化20分钟。冲洗后，将神经元孵育在抗抑制蛋白抗体（1：500）和抗MSCARLET抗体（1：500）（多克隆鸡肉抗体，突触系统，409006，RRID AB_2725776）中，在PGT中稀释，随后是ALEXA Fluor 647 conjii-andy tandy，Fisher Scientific，A21235，RRID AB_2535804）和Alexa Fluor 594偶联的抗Chicken抗体（1：500）（Thermo Fisher Scientific，A11042，RRID AB_2534099）。将样品与DAPI一起安装在Fluoromount-G中。用Leica DM5000落叶显微镜对样品进行成像，并具有适用于荧光团波长的过滤器，由metamorph控制的SCMOS数码相机（Hamamatsu Flash 4.0 V2）（版本7.8.4.4.0）。
为了摄取转铁蛋白配体，将培养的大鼠神经元在37°C的HBS中饥饿10分钟，然后在37°C的HBS中与50μgml -1的Thermo Fischer Scientific，T23366，T23366，T23366，T23366，T23366，T23366，T23366，Themero Fischer Scientific饥饿10分钟。用冷HB迅速洗涤后，将细胞剥去表面结合的转铁蛋白-Alexa647，用甘氨酸缓冲液（100 mM NaCl，50 mm甘氨酸，50毫米甘氨酸，pH 3，300 MOSM）两次冲洗，用冷HB冲洗，并用4％多羟基甲醛/4％的PBS固定在室内温度下的PBS中，固定在15分钟的PBS中。对于表面标记，将神经元与转铁蛋白-Alexa647在4°C孵育10分钟，然后用冷HBS快速洗涤并固定。然后将细胞用PGT通透，并用抗TFR抗体（1：1,000）（克隆H68.4）（Thermo Fisher Scientific，13-6800，RRID AB_2533029），然后用抗小鼠ALEXA568偶联物（1：500）（1：500）（1：500）（Thermo Fishercientic，a a ab_25），A a a ab_111004，RID。将样品安装在带有DAPI的Fluoromount-G中，并在具有63倍物镜和488、561和634 nm照明的旋转盘共聚焦显微镜上成像。GFP，Alexa568和Alexa647通道获得了一堆相距0.5μm的焦平面。所有通道的最大强度投影用于定量荧光测量。我们在Alexa568通道中定义了单元的掩模，并将其用于量化转铁蛋白– Alexa647标记。
男性人类胚胎干细胞系H1在MTESR1培养基（干细胞技术）的无馈物条件下培养。简而言之，每天更换媒介。当80–90％汇合时，用ACCUTASE（创新细胞技术）处理细胞，以1,000 rpm收集和离心3分钟，在MTESR1中重新悬浮，用噻硫代蛋白（2μm，Bio，Bio Vision）在MTESR1中重新悬浮，并将其镀在Matrigel（Bd Biosciences）上（BD Biosciences）。小鼠神经胶质细胞从新生儿野生型CD1（Charles River）小鼠的前端分离出来。在室温（20–22°C）的湿度为30–70％的室温（20–22°C）和12小时的浅色周期中饲养小鼠。In brief, newborn mouse forebrain was digested with papain for 30 min and plated onto 10 cm dishes in DMEM (Thermo Fisher) supplemented with 10% calf serum (GE healthcare life sciences), sodium pyruvate (Thermo Fisher), MEM Non-Essential Amino Acids (Thermo Fisher), penicillin/streptomycin (Thermo Fisher), and 2-mercaptoethanol（Sigma）。所有鼠标程序均由斯坦福大学的行政实验室动物护理（APLAC）批准。
如先前所述，在HEK293T细胞（ATCC）中产生了慢病毒。62。表达载体和三个辅助质粒（PRSV-REV，PMDLG/PRRE和VSV-G）与聚乙基亚胺共转染。慢病毒颗粒被超中心，在DMEM中重新悬浮，在-80°C下储存。The following lentivirus constructs were used: FUW-TetO-Ngn2-T2A-puromycin, FUW-TetO-Ngn2-T2A-blasticidin, FUW-TetO-Flag-GluA1-T2A-puromycin, FUW-TetO-Flag-DNER-T2A-puromycin, FUW-TetO-Flag-DNER-NF-186-T2A-puromycin,FUW-TETO-FLAG-DNER-NF-186（FIGQD）-T2A-PUROMYCIN和FUW-RTTA。从addgene质粒＃51053亚克隆将fuw-teto-flag-lag-dner质粒从addgene质粒＃64942亚克隆，使用gibson装配方法从addgene质粒＃64942亚克隆。
如所述，生成NGN2-IN细胞。在第0天，将胚胎干细胞铺板为6 cm盘中的分离细胞（8×105细胞）。在镀层时，细胞被含有NGN2-T2A-T2A-PUROMYCIN或NGN2-T2A-T2A-blasticidin和RTTA的溶质病毒感染。在第1天，将培养基替换为N3培养基（DMEM/F12（Thermo Fisher），N2（Thermo Fisher）和Mem非氨基酸（Thermo Fisher），这些氨基酸（Thermo Fisher）含有胰岛素（Sigma）），其中包含多克环素（2μgMl-1，Sigma），并培养了培养物，并将其培养为培养物，并培养了培养物，并将其培养为培养。几周。从第2天到第4天，使用嘌呤霉素或blasteridin来选择转导的细胞。在第3天，将表达旗帜标记的受体的慢病毒添加到板上进行实验，需要表达旗帜标记的受体。在第5天，添加ARAC（4μM，Sigma）以去除分裂的细胞。在用FuW-Teto-Flag-Glua1-T2A-Puromycin处理的细胞中选择。在第6天，在细胞中通过ACCUTASE分离，如上所述离心，在Neurobasal（Thermo Fisher）中与B27（Thermo Fisher），Glutamax（Thermo Fisher）和5％胎牛血清（FBS，GE Healthcare）重新悬浮。将3小鼠神经胶质细胞添加到细胞悬浮液中，并将其镀在涂有基质胶的盖玻片上（细胞中的5–7.5×104，每孔的24孔板的3×104小鼠胶质细胞）。在第8天，用B27，谷氨酸，2％FBS和ARAC（4μM）更改为Neurobasal。每三到四天一次交换培养基的30％。转基因诱导后两到四个星期分析培养物。
C57BL/6J小鼠（Jackson 000664）在室温下饲养，湿度为40-60％，湿度为12小时，可免费获得食物和水。从P0新生儿男性和雌性野生型小鼠中解剖海马，并通过木瓜蛋白酶消化解离，通过70 µm的细胞滤网过滤，并在24孔板中的聚赖氨酸涂层覆盖物上铺路。在37°C下的5％CO2的加湿孵化器中，在神经乳突中维持培养物，并在加湿的培养箱中补充了培养基。在实验前将神经元培养14天。所有鼠标程序均由斯坦福大学的行政实验室动物护理（APLAC）批准。
DIV14小鼠神经元培养物用PBS洗涤3次，持续1分钟。然后在室温下用PBS中的PBS中用4％多聚甲醛固定细胞15分钟。将细胞洗涤3次，持续5分钟，然后在室温下在阻塞和透化缓冲液中孵育1小时（5％正常驴血清，0.3％Triton-100，在PBS中为0.05％叠氮化钠）。加入在TBST中稀释的一抗（TBS中的0.1％Tween），并在4°C下孵育过夜。然后将细胞用TBST洗涤3次，持续5分钟，然后在室温下与TBST稀释1小时孵育1小时。将细胞用TBST洗涤3次，持续10分钟，然后在载玻片上用延长的钻石抗弹药（Thermo）安装进行成像。在使用DynGO 4A处理的实验中，将30μMDYNGO4A用于用作媒介物对照的DMSO的血清饥饿条件。
DIV14或DIV26诱导的人神经元培养物用PBS +++缓冲液洗涤（0.5 mM CaCl2，1 mM MGCL2，PBS中的4％蔗糖）。然后在室温下用PFA+缓冲液（4％多聚甲醛和4％蔗糖）固定细胞10分钟。然后用PBS洗涤细胞3次。将细胞用0.2％Triton X在PBS中透化10分钟，并用PBS洗涤3次。然后将细胞在室温下阻止缓冲液（4％BSA，1％宇宙小牛血清）中孵育一小时。加入在阻塞缓冲液中稀释的一抗并在4°C下孵育过夜。将细胞用PBS洗涤4次，然后在室温下添加1：1,000的二级抗体1：1,000。将细胞在PBS中洗涤3次，然后用DAPI Fluoromount-G（南部生物技术）或延长钻石抗弹药（Thermo）在载玻片上进行成像。在使用DynGO 4A处理的实验中，将30μMDYNGO4A用于用作媒介物对照的DMSO的血清饥饿条件。
以下主要抗体用于免疫荧光研究：MAP2（ABCAM AB5392（1：1,000），ABCAM AB32454（1：500））;MAP2A/B（Encor Biotech GPCA-MAP2A/B（1：500））;Ankyring（克隆N106/36，Sigma Mabn466（1：1,000），突触系统386 003（1：500），突触系统386 005（1：500））;网格蛋白重链（ABCAM AB21679（1：500））;AP-2复合物亚基α1（ABCAM AB189995（1：500））;α-ADAPTIN（克隆AP6，Thermo MA1-064（1：500））;RAB-7（EPR7589，ABCAM AB137029（1：250））;RAB7A/RAB7（LSBIO LS-B13237-100（1：250）），TGN46（Biorad AHP500G（1：1,000））;βIII微管蛋白（ABCAM AB41489（1：1,000））;L1CAM（克隆UJ127.11，Sigma L4543（1：100））;谷氨酸受体1（Sigma AB1504（1：100））和FLAG（Millipore Sigma F7425（1：1,000））。所有使用的抗体都是标准的商业抗体。除L1CAM外，所有染色都是在固定后进行的。为了在人类神经元中标记L1CAM，进行了活染色。如上所述，在37°C（20μgml-1）的37°C（20μgml-1）中添加了30分钟的人类特异性克隆UJ127.11（Sigma-Aldrich），如上所述。
The following secondary antibodies were used for immunofluorescence studies (all diluted 1:500): rabbit polyclonal anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher A27012), donkey polyclonal anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488 (Thermo Fisher A32766), goat polyclonalanti-chicken IgY (H+L) Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher A21437), donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555 (Thermo Fisher A32816), goat polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher A27039), donkey多克隆抗sheep IgG（H+L）Alexa Fluor 555（Thermo Fisher A21436），山羊多克隆抗chicken Igy（H+L）Alexa Fluor 647（Thermo Fisher A21449）Dylight 405 Affinipure驴抗Chicken Igy（IgG）（H+L）（Jackson 703-475-155），Dylight 405 Affinipure驴抗小鼠IgG（H+L）（H+L）（Jackson 715-475-151）711-545-152），Alexa Fluor 488 Affinipure驴抗goat IgG（H+L）（H+L）（Jackson 705-545-147），Alexa Fluor 594 Affinipure Donkey Donkey Donkey anti anti anti anti anti anti anti anti anti antike igg（h+l）(H+L) (Jackson 715-605-151), Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) (Jackson 703-605-155), Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) (Jackson 706-605-148) and Donkey anti-GoatIgG（H+L）高度交叉吸附的二抗Alexa Fluor Plus 647（Thermo A32849）。
旋转，裁剪并拉直图像以生成显示图像。通过测量指示区域中的平均荧光强度来分析图像，并使用没有细胞的盖玻片的附近区域减去背景。仅分析了没有重叠神经突重的细胞区域。使用以下标准选择神经元进行分析：（1）具有明显可识别的细胞体，其AIS远离细胞体（基于强的脚踝标记）和（2）具有易于跟随轴突区域的AIS。选择轴突区域是AIS强的脚踝标记的远端。与神经元的树突状结构域相比，这些轴突区域的MAP2染色也明显降低。
相互作用筛选是基于修改的细胞外相互作用分析策略，如先前报道的64，并适用于384孔板，以适应较大的蛋白质。从常见的神经元细胞表面受体家族中选择的380个蛋白质以诱饵格式克隆到果蝇培养表达质粒中，具有FC标签，并采用pentameric螺旋线圈结构蛋白，随后是人胎盘碱性碱性磷酸酶。所有蛋白质均以果蝇S2细胞的形式表达并分泌，并根据制造商的指示而没有修改，并使用Transit-insect转染试剂（Mirus，mir 6104）进行瞬时转染（Mirus，mir 6104）。将诱饵蛋白直接从条件培养基上直接捕获到蛋白A涂层的384孔板上，在4°C下过夜，用1×PBS洗涤，包括0.1％BSA，1 mM MGCL2和1 mM CACL2，然后在室温下以3-H型在室温下通过prey蛋白和二次洗涤进行室温。使用650 nm处的发色底物kpl蓝ephos（Seracare，5120-006）的吸光度检测到结合。为了进行分析结果，我们遵循了先前实施的修剪Z得分策略，其中删除了最低和最高值（每个）（每个）的最高值（每个）（每个），以计算每个测量集合的修剪平均值和标准偏差，然后将其用于计算Z分数（即用于所有测量的平均值）。
对于表面等离子体共振实验，将DMA-1外生域（氨基酸LEU20至LEU507）克隆在基于PACGP67A的改良的杆状病毒转移质粒中，旨在分泌具有C-末端AVI标签的蛋白质，用于Biotinylation和Hexahistidine Tag，以用于蛋白质素质。同样，将缺乏信号肽的LRPL-1 cDNA用六个月标签克隆到PACGP67A中。两种蛋白质在感染杆状病毒后，成功地从高五个细胞中分泌成培养基，表明LRPL-1是一种分泌的蛋白质。用Ni-NTA琼脂糖树脂（Qiagen）用固定的金属亲和色谱纯化蛋白质，然后在HBS（10 mM HEPES pH 7.2，150 mm NaCl）中进行尺寸 - 排斥色谱法。将LRPL-1与大肠杆菌生物素连接酶Bira孵育以进行生物素化。使用Biacore X100（GE Healthcare）上的链霉亲和素芯片在HBS中捕获LRPL-1，在HBS中使用0.05％Tween-20和0.1％牛血清白蛋白捕获LRPL-1，以降低DMA-1与芯片表面的非特异性结合。使用制造商的评估软件（BIACORE X100评估软件，版本2.0.2）对传感器进行分析。动力学拟合分别为4.6×103 m -1s -1和0.018 s -1的动力学拟合（KON和KOFF值），导致分离常数（KD）为3.9 µm。稳态分析的KD相似为6.9 µm。两种分析都遭受了有限的非特异性结合，这可能解释了两个KD值之间的两倍差异。
所有数据均表示为平均值±S.E.M.样本量是指秀丽隐杆线虫动物或神经元的数量。散点图显示了平均值和S.E.M.的叠加层，每个点代表一个单独的秀丽隐杆线虫动物，神经元或神经元区域。因此，n是每个散点图中的点数。统计比较在Prism 8.0软件（GraphPad软件）中进行。统计显着性测试在图传说中指定。每个秀丽隐杆线虫在体内测量（FRAP或荧光强度）都来自不同的动物。在至少两个独立的成像会议上，将所有秀丽隐杆线虫在体内成像数据中复制。每个脊椎动物神经元的测量都来自不同的神经元。所有脊椎动物神经元成像数据均来自至少三个独立的神经元培养物和至少三个独立的成像实验。所有显示代表性数据的实验均以相似的结果重复。独立的实验代表独立的生物学重复。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。