当前的研究是使用从现有的临床试验中收集的患者样本进行的二级研究，宾夕法尼亚大学机构委员会为此提供了洞察力。从患有复发/难治性B的患者中获得了CAR T细胞的输注前样品，参与了I/IIA期阶段，旨在评估CTL019 T细胞疗法的安全性和可行性（临床过程）（GOV：NCT01626495）或试点的临时theriz theriz theriz the tocil tocil tocil tocil cartiz tosizab in to tociliz cy tocimab，综合征（ClinicalTrials.gov：NCT02906371）。这两项试验均在费城儿童医院和宾夕法尼亚大学共同进行。在参与之前，患者或其监护人根据赫尔辛基宣言中概述的原则提供了书面知情同意。实验室程序严格遵守国际良好临床实践协调会议制定的准则，采用标准化的操作程序和协议来接收，处理，冻结和分析样本。在整个研究中，严格遵守严格的道德法规。HDS的原发性T淋巴细胞由宾夕法尼亚大学人类免疫学核心提供。为了确保遵守HIPAA法规，所有样品在分析之前已被除名。

　　通过标准白细胞术收集自体外周血单核细胞。随后，通过单核细胞的放逐富集T细胞，然后使用抗CD3/CD28涂层的顺磁珠进行彻底洗涤和激活。构建了先前描述的具有4-1BB/CD3ζ转基因的CD19特异性CAR的慢病毒载体36，然后在激活阶段将其用于转导细胞，并在培养物启动后3天被洗净37。使用摇摆平台（波生物反应器系统）促进细胞膨胀，持续8至12天，然后将珠子磁去除。最后，收集CTL019细胞并冷冻保存以供将来使用。

　　我们使用小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞开发了人造APC，以激活针对相应抗原的CAR T细胞。NIH/3T3细胞系最初是从美国型培养物中（ATCC）采集的，并在DMEM培养基（Gibco，11995-065）中维持，并在37°C的Humidifiend Inculator设置为37°C中，并在5％CO2的37°C中安装了10％胎牛血清（FBS; Gibco，16000044）。达到约80％的汇合度后，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200056）将细胞与培养瓶分离，并用编码人CD19的慢病毒载体转导。然后，转导后3天，将1×106细胞用特异性表位的抗体标记，并使用FACSARIA（BD）分类器对转基因进行分类，以达到超过99％的纯度，在引入转基因后的纯度超过99％。在遗传修饰之前和之后，进行了支原体污染和身份验证的常规筛查。随后，选择了稳定的表达克隆以在T25或T75烧瓶中扩展，并冷冻存储以供将来使用。

　　CTL019 cells were thawed and cultured in OpTmizer T-Cell Expansion Basal Medium (Thermo Fisher Scientific, A1048501) supplemented with GlutaMAX Supplement (Thermo Fisher Scientific, 35050061) and 5% human serum AB (Gemini Bioproducts, GEM100-512) in a humidified incubator for an initial overnight rest on day 1. On day 2, dead cells were eliminated根据制造商的说明，使用死细胞去除试剂盒（Miltenyi Biotec，130-090-101），并在启动共培养分析之前使用血细胞计数列出了特定数量的细胞。为了用CD19-3T3细胞（APC细胞）刺激，将1×106 CTL019细胞与等效数量的APC细胞合并为2 mL的培养基；为了评估未刺激的条件，准备了1×106细胞。将所有悬浮液培养在RPMI培养基（Gibco，11875-119）中，并在组织文化处理的24孔板（Thermo Fisher Scientific）中补充了10％FBS，在孵化器中培养12小时。对于评估CAR T细胞种群对2型细胞因子的反应的功能实验，将重组人IL-4，IL-5或IL-13（R＆D Systems，204-IL-010，205-IL-010，205-IL-010，213-ILB-010）分别添加到指定浓度的介质中。共培养后，通过剧烈的移液收集细胞，并通过20μm的过滤器将细胞悬浮液通过PE标记的单克隆抗FMC63单链单链可变片段（SCFV）抗体（CAR19）（CAR19）（Y45，Acro Biosystems，acro Biosystems，fm3-hpy53-et 4 H4 cat for），以去除团块以去除团块以去除团块。随后，将细胞用抗PE Microbeads Ultrapure（Miltenyi Biotec，130-105-639）标记，并加载到位于MacS分离器磁场中的MACS柱上。磁性保留在色谱柱中的CAR+细胞被分离为正面选择的部分，而未转导的CAR-细胞流过。

　　我们使用了标签试剂进行样品条形码，使八个样品合并到一个单车道中进行分析期间以随后的反复进行。具体而言，对于人类样品，主题标签由两种识别无处不在的表面标记的抗体CD298和β2微球蛋白组成，每个抗体均与含有条形码序列的相同寡核苷酸偶联。磁性选择的CAR+细胞从前面的步骤获得，源自四个个体，以及来自每个个体的相应基础未刺激的CAR T细胞，使用5 µL人类信任FCX FCX FC阻断试剂（Biolegend，4222302）进行阻断。随后，将它们与1-9（Biolegend）的1-9（Biolegend）的1 µL（0.5 µg）在4°C下孵育30分钟。染色后，将样品用500 µL的细胞染色缓冲液（Biolegend，420201）洗涤两次，并汇集成单管。然后将组合细胞根据制造商的方案，将每种总SESSEQ-B抗人抗体（Biolegend）的抗体鸡尾酒中孵育。该面板包括针对各种细胞表面标记的抗体选择，包括CD4（RPA-T4，300565），CD8（SK1，344757），CD45RA（HI100，304161），CD45RO（CD45RO（UCHL1，304257），CD62L（CD62L（CD62L（dreg-dreg-56，3048849）），FRAS，FRAS，304849）CD127（A019D5，351354），CD28（G043H7，302961），CD27（O323，302851），CCR7（G043H7，353249），HLA-DR（HLA-DR329961），TIM3（F38-2E2，345053），LAG-3（11C3C65，369337），CTLA-4（BNI3，369629）和Tigit（A15153G，372727）。

　　使用Chromium单细胞3'库和凝胶珠Kit v3.1（10x Genomics，PN-1000268）制备SCRNA-Seq库。Initially, 20,000 TotalSeq antibody-stained CAR T cells were suspended in PBS (Gibco, 14190-144) with 0.04% bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, A7030) buffer and loaded onto the Chromium Next GEM chip G, where cells and uniquely barcoded beads were partitioned into nanolitre-scale gel beads-in-emulsion（宝石）。在每个宝石中，都会发生细胞裂解，然后通过PCR逆转录释放的mRNA，并通过PCR分离和扩增12个周期。随后的主题标签/表面蛋白寡聚源性cDNA的分离（<200 bp) and mRNA-derived cDNAs (>使用0.6×Spri珠（Beckman Coulter）在cDNA反应上纯化完成300 bp）。碎裂后，末端修复和聚（A）尾巴，并入样品指数，并进行扩增。在Illumina Novaseq 6000测序系统上进行测序之前，最终库进行了质量控制检查，其长度为150 bp。在基因和标签/表面蛋白库的合并率为8：1的基因/标签/表面蛋白质库的汇总，将三个样品汇总并测序。

　　表观基因组景观和基因表达在同一单个核中的单细胞综合性是使用Chromium Next Gem单细胞多组ATAC +基因表达试剂盒（10x Genomics，PN-1000283）进行的。最初，从6例患者刺激CD19-3T3刺激的CAR+细胞，有或没有10 ng Ml-1 IL-4补充剂，进行了洗涤，计数和核分离，并具有3分钟的优化裂解时间。随后，将分离的核悬浮液在含有转座酶的转置混合物中孵育，从而促进开放染色质区域中DNA的优先片段化。同时，将适配器序列引入DNA片段的末端。然后将大约9,250个核加载到铬下一个宝石芯片J上，以最终回收约6,000个核。在GEM生成过程中，凝胶珠引入了一个聚（DT）序列，该序列可以从mRNA中产生条形码的全长cDNA，用于基因表达分析，并促进了促进条形码附着在转置DNA片段上进行ATAC分析。在GEM孵育，纯化和放大前PCR之后，使用标准方案构建了单独的ATAC和基因库。经过质量评估后，两个文库在Illumina Novaseq 6000测序系统上进行了配对的150 bp读取测序，ATAC库的每个核的平均深度为24,305个读取对和基因库的每个核的13,756读对。

　　共培养的细胞进行了一系列的处理步骤，以进行免疫染色。最初，它们在PBS中两次洗涤，然后在室温下用活死蓝色检测试剂（Thermo Fisher Scientific，L34962）染色20分钟，在PBS中稀释至1：800，以评估细胞活力。接下来，将细胞在FACS染色缓冲液中洗涤两次，然后在室温下染色20分钟。为了固定染色的细胞，在室温下使用细胞膜/细胞处理剂/透化试剂盒（BD Biosciences，554714）20分钟，同时受到保护。随后，用1×pers/Wash缓冲液洗涤细胞两次，然后使用PERM/WASH缓冲液中的抗体对CAR19和细胞内细胞因子进行染色。在黑暗中，在室温下进行染色过程20分钟。然后，细胞在FACS染色缓冲液中重悬之前，再用PERM/WASH缓冲液进行了另外两次洗涤，以进行后续分析。The following antigens were stained using the specified antibody clones: anti-FMC63 scFv (Y45, ACRO Biosystems, FM3-HPY53), CD3 (SK7, BD Biosciences, 564001), CD4 (OKT4, BioLegend, 317442), CD8a (RPA-T8, BioLegend, 301042), CD19（HIB19，BD Biosciences，561121），CD14（M5E2，BD Biosciences，561391），IL-3（BVD3-1F9，Biolegend，500606），IL-4（IL-4IL-13（JES10-5A2，Biolegend，501916）和IL-31（1D10B31，Biolegend，659608）。染色期间以1：100稀释使用细胞表面抗体，在1:50稀释的细胞内抗体。在Cytek Aurora流式细胞仪上分析了样品，并使用FlowJo V.10.8.0进行了数据分析。

　　用CD19-3T3细胞刺激后，处理约30,000个磁性富集的CAR+细胞进行膜染色（Isoplexis，染色1001-1）。随后，将这些细胞加载到等码芯片上（等线芯，等码1001-4），其中包括12,000个腔室，阵列中有32个细胞因子捕获抗体的阵列。将芯片进一步在37°C的隔离机中进一步孵育16小时，并补充5％CO2。然后，使用检测抗体的鸡尾酒来检测分泌的细胞因子，然后进行荧光标记。使用IsoSpeak v.2.8.1.0（Isoplexis）分析所得的荧光信号，以确定特定细胞因子分泌细胞的数量和每个细胞因子的强度水平。为了进行下游分析，提取了与2型细胞因子有关的原始数据，包括IL-4，IL-5，IL-9，IL-9，IL-10，IL-13和IL-21。

　　为了产生STAT6和GATA3敲低的CAR T细胞，首先在HEK293T细胞中生产了含有STAT6（SHSTAT6）和SHGATA3的短发夹RNA（SHSTAT6）和SHGATA3的慢性病毒颗粒。细胞系最初是从ATCC获得的，并测试了支原体污染的阴性。这些细胞用编码PCMV-VSV-G（Addgene，8454），PCMV-DR8.2 DVPR（Addgene，8455）的质粒（Addgene，8454）和PLKO.1-PURO_SHSTAT6（PLKO.1-PURO.1-PURO，ADDGENE，ADDGENE，8453​​）或PLKO.1-PUIUM MENTACH trainf Franffrflffthff，将这些细胞转染。随后在连续两天用SHSTAT6或SHGATA3慢病毒颗粒自旋转导的CAR T细胞转导，以确保有效的转导。SHSTAT6或SHGATA3序列的池如下：

　　SHSTAT6-1：5'-CCGGGCGGCTCTATGTCGACTTCCTCCTCGAGGAAAGTCGACATCAGAGCCCGCTTTTTTTG-3';SHSTAT6-2：5'-CCGGAGCACCCTTGAGAGCATATATCTCGAGATATATATATGCTCTCAGGGTGCTTTTTTTTTTG-3';SHGATA3-1：5'-CCGGAGCCTAAACGCGATGGATATATACTCGAGTATATATATCCATCGCGCGCGTTTAGGCTTTTTTTG-3';SHGATA3-2：5'-CCGGCCCAAGAACAGCTCGTTTAACCTCGAGGTTAAACGAGCTGTTCTTCTTCTTGGGTTTTTTG-3'。在使用前，将所得的汽车T细胞额外扩展了2天。在基因和蛋白表达水平上都评估了敲低效率，以确认STAT6和GATA3沉默的功效。

　　细胞因子人磁30-plex面板（Invitrogen，LHC6003M）用于检测我们发现队列中包含33例患者的队列中的血清蛋白。根据制造商的方案对血清样品（在CTL019输注后的2天到63天）进行冷冻样品，跨越了CTL019输注后的63天，并分析了血清样品。使用FlexMAP 3D仪器（Luminex）进行了测量，并使用Xponent软件（Luminex）进行数据采集和分析。此外，使用我们验证队列中的八名患者中的Olink Explore 384面板（Olink蛋白质组学）用于测量八名患者的血清蛋白，所有蛋白质数据都报告在Log2量表上的归一化表达值中。在发现队列中，在给定时间范围内，各种患者的不同日子可能已经进行了血清收集。在验证队列中，在指定日期对所有患者持续进行血清收集。

　　从查尔斯·河实验室（Charles River Laboratory）购买了点头/SCID/IL-2RγNull（NSG）小鼠（6周）。所有小鼠均位于EPFL的苯比（CPG）动物设施的中心，在19-23°C的单独通风笼中，湿度为45-65％，并保持在12 h – 12 h的深色光周期。所有涉及小鼠的实验程序均由瑞士当局（Vaud的广州，动物协议ID 3533）在道德上批准，并遵守EPFL CPG提出的指南。筛选了来自ATCC的NALM6细胞系，并确认没有支原体污染。这些细胞用GFP-荧光素酶慢病毒稳定转导，用于下游实验。在补充10％FBS和200 U ML -1青霉素 - 链霉素的RPMI培养基中培养NALM6细胞（Gibco，15140122）。

　　总共1×106 NALM6-荧光素酶细胞为静脉注射到NSG小鼠中以建立白血病异种移植小鼠模型。肿瘤注射后在开始治疗前随机分组小鼠。然后，1周后，通过尾静脉注射将2×106的CAR T细胞分析。每周使用Xenogen IVIS荧光/生物发光成像系统（Perkinelmer）监测肿瘤生长。简而言之，将小鼠腹膜内注射生物发光底物-luciferin钾盐（每公斤150毫克； ABCAM，AB143655）。然后，注射后10分钟，将小鼠麻醉并受到发光成像系统以量化肿瘤负担。在输注CAR T后17天，将存活的小鼠用1×106 NALM6-荧光素酶细胞重新收集。当体重减轻超过基线体重的15％或研究人员发现任何不适的迹象或兽医每隔一天监测小鼠的建议时，都会对小鼠进行安乐死。

　　根据先前确定的方案，CTL019细胞被解冻并静置3-4小时，然后用PE标记的单克隆抗FMC63 SCFV抗体和抗PE微粒进行顺序染色。然后将使用MAC柱富集的CAR+细胞与NALM6细胞以指定的E/T比共培养。在整个测定期间，每天使用流式细胞术评估CAR T细胞和NALM6细胞的数量。根据需要添加其他NALM6细胞，以维持指定的E/T比。每个评估的条件均以3或4个技术重复准备。

　　增强2型汽车T细胞的制造过程很大程度上遵守了先前建立的方案，其显着修改涉及在整个培养和扩展过程中添加IL-4的10 ng ml-1或50 ng ml-1（R＆D Systems，204-IL-010）。除了标准纳入IL-7（Miltenyi Biotec，130-095-367）和IL-15（Miltenyi Biotec，130-095760）的标准包含5 ng ml-1外，还引入了这种补充。

　　从指定的时间点从尾部收集小鼠血（50μl），以进行外围CAR T细胞分析。将收集的样品重悬于具有EDTA（2 mM）的PBS中，并使用ACK裂解缓冲液（Gibco，A1049201）去除红细胞。对于表面标记染色，将细胞与抗体面板在4°C孵育30分钟，然后进行活/死染色。然后用0.2％BSA洗涤细胞并将其重悬于PBS中，以进行流式细胞仪分析。通过细胞刺激鸡尾酒（Invitrogen，00-4970-03）在37°C诱导细胞因子诱导细胞因子的产生，用细胞刺激鸡尾酒（Invitrogen，00-4970-03）进行第一次刺激细胞进行细胞内细胞因子染色。随后，对表面标记物进行染色，并如前所述为活/死染料进行染色，然后使用细胞膜/细胞处理剂试剂盒（BD Biosciences）固定并透化。根据制造商的方案进行了用指示的抗体面板进行细胞内染色。使用带有Attune NXT软件v.3（Invitrogen）的Attune NXT流式细胞仪收集数据，并使用FlowJo v.10.6.1（Tree Star）进行分析。通过同种型对照和荧光微米对照确定栅极边缘。

　　从Biolegend购买了以下抗体，每种抗体均在体外和体内功能分析中用于流式细胞仪分析：FAS（DX2，305624），IL-13，IL-13（JES10-5A2，5AA2，501916），CD27（LG.3A10，1242382382382）（MAB11，502940），CD3（OKT3，317306），GZMB（GB11，515403），CD223（lag-3）（lag-3）（11c3c65，369312），CD366，TIM3（tim3）（tim3）（f38-2e2，345016），CD197（CCRCCRCCRCCR）（34）（335）（335）（34）（34）（34）（34）（33 H）IL-4（MP4-25D2，500832），CD19（HIB19，302216），CD4（OKT4，317416），IL-5（TRFK5，504306），CD8（SK1，344724），CD279（CD279（2f1/klrg1，138426），IFNγ（4S.B3，502530）和僵尸Aqua Ableable固定可行性套件（423102）。单克隆抗FMC63抗体（Y45，FM3-HPY53）购自Acro Biosystems。在染色期间以1：100稀释，1:50稀释的细胞内抗体使用细胞表面抗体，并以1：1,000稀释的活/死染色。

　　总共测序了44个配对的scrna-seq和cite-seq库；补充表2中提供了详细的数据质量指标。测序数据经过了与GRCH38人类参考基因组的比对，其次是条形码和唯一的分子标识符计数，最终使用细胞ranger v.6.1.2（10X基因组学）生成数字基因表达矩阵。随后的数据分析是根据Seurat V.4 Pipeline38进行的。标签寡素的表达被用来将其解散为原始样本，同时还识别和排除了跨样本双重套件。分析中省略了以双重（检测到两个条形码）或缺乏条形码的细胞。仅保留了从200至7,000的基因计数表达基因计数且线粒体基因含量少于10％的细胞进行下游分析。对于整个数据集分析（图1B），实现了随机分组方法，其中每个4个库被合并并指定为单批，导致11种不同的批次。随后，将一种名为相互主成分分析（PCA）39的快速集成方法与默认参数一起使用，以减轻潜在的批处理效果并启用大规模数据集成。这涉及将数据集基于测序批处理，独立的归一化和每个数据集的可变特征识别将数据集分配到seurat对象中。集成和PCA是在跨数据集的重复可变特征上进行的，并使用FindIntegrationance函数识别锚，并与IntegratedAta进行了随后的数据集集成。然后实现用于可视化和聚类的标准工作流。从发现和验证队列中，用于基础未刺激或CD19-3T3刺激的CAR T细胞的亚集群分析， 使用Seurat中的Sctransform归一化方法40。该方法专门设计用于捕获SCRNA-Seq数据集中的更清晰的生物学异质性，对于这些分析，没有观察到显着的批处理效应。使用Findmarkers函数鉴定了DEG，以在细胞组或簇之间进行成对比较，并应用对数转换的倍数变化阈值为0.25，以选择重要的基因。此外，使用AddModulesCore函数计算基于预定义基因集的模块得分。

　　细胞游侠ARC v.2.0.2（10x基因组学）用于执行样品反复插图，条形码加工，开放染色质区域的鉴定以及从测序数据中同时计数转录本和单个单元中的峰值可及性。使用Signac（V.1.12.0）41和Seurat（V.4）38，每个条形码矩阵的输出进行了关节RNA和ATAC分析。计算人均质量控制指标，包括核小体带模式（存储为核心组_signal）和ATAC分量的转录起始位点（TSS）富集评分。这些指标用于识别和删除异常值，每个样本的质量报告在补充表4中进行了仔细记录。符合默认设置的质量过滤标准。Specifically, cells were retained if they exhibited an ATAC peak count ranging from 1,000 to 100,000, a gene count ranging from 1,000 to 25,000, a nucleosome_signal below 2 and a TSS enrichment score exceeding 1. To enhance the accuracy of peak identification, we used MACS2 v.2.2.9.1 with the CallPeaks function, a widely used tool for peak calling in chromatin accessibility analysis42.随后，我们构建了一个联合邻居图，该图代表基因表达和DNA可及性测量，并使用Seurat v.4中的加权最近的邻居方法进行了测量。为了研究目标基因的潜在调节元素，我们使用了linkpeaks功能。该方法可以通过计算附近峰值的基因表达和可及性之间的相关性来确定可能调节基因表达的峰集，同时由于GC含量，整体可访问性和峰值大小而纠正偏差。为了准备主题分析，我们使用了AddMotifs函数将DNA序列基序信息集成到数据集中。此外，我们使用Chromvar43计算了人均基序活性评分。对于具有位置信息的主题的足迹分析， 我们使用足迹功能来收集和存储所有必要的数据在测定中。

　　R Toolkit Connectome（V.1.0.0）44用于使用带有默认参数的SCRNA-SEQ数据集中的配体和受体表达值调查细胞 - 细胞连接模式。标准化的seurat对象用作输入，群集身份用于定义交互网络中的节点，从而通过特定的L – R机制获得了连接节点对的边缘列表。我们选择了顶级交互对进行可视化，优先考虑那些基于每对的缩放权重，更可能在生物学和统计上具有重要意义的相互作用。边缘的厚度与相关权重成正比，较宽的边缘表明相互作用水平更高。来源。包括和目标。包括参数来指定发射配体信号的源群集和表达感知配体的受体基因的靶簇。

　　Ingenity途径分析（Qiagen）45用于识别由表征每个已识别群集或响应组的DEG调节的基础信号通路。为了实现这一目标，将DEG列表以及每个基因的相应倍数变化值，P值和调整后的P值加载到数据集中。使用独创性知识库（仅基因）作为参考集，进行了核心表达分析。从确定的规范途径中特异性选择了与T细胞相关的信号通路，以表示每个组的主要功能曲线。使用z评分度量确定特定途径的激活或抑制水平。从概念上讲，z得分是一种统计措施，评估了我们DEG数据集中分子的实际表达模式与基于文献的预期模式的实际表达模式（z> 0）（z> 0，激活/上调； z <0；抑制/下调；z≥2或z≤-2或z≤-2是显着的）。使用右尾Fisher的精确检验确定了每个确定的信号通路的重要性，其P值反映了我们SCRNA-SEQ数据集分子之间关联的可能性和规范途径参考数据集。

　　使用Prism V.10（GraphPad）或R V.4.3.1进行统计分析。除非另有说明，否则数据表示为平均值±S.E.M.对于涉及三个或更多组的比较，我们使用了Tukey的多重分析测试，使用了单向方差分析。为了进行比较，将两尾Mann-Whitney U检验用于非参数数据，两尾学生的t检验，用于参数数据和两尾Wilcoxon匹配对签名签名的额定测试，用于配对的非参数数据。对于通常在小提琴图中描绘的单细胞级比较（如扩展数据图7b，j），比较中包括每个BCA组中每个患者的前10％单细胞的归一化表达值。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。