化合物1（ZINC21803075，D475-1631）购自Chemdiv，并在补充信息中描述了化合物2-6的合成。依托泊苷和Camptothecin购自Sigma-Aldrich（E1383和208925）。ATM抑制剂KU-55933和AZD1390购自SelleckChem34。
Two constructs comprising the core helicase domain of human WRN (amino acids of 517–945), with either five (hWRN_mut5: E625A, R716A, K804A, E886A, R942A) or six (hWRN_mut6: R564A, E625A, R716A, K804A, E886A,将R942a）点突变与N末端Hexa-Histidine标签和ZZ标签克隆，然后是重组杆状病毒生成的预缩蛋白酶裂解位点。引入了表面突变，以促进WRN解旋酶结构域的结晶35。蛋白质表达是在感染的Spodoptera frugiperda（SF9）细胞中进行的。将细胞与120 rpm，27°C的摇动一起孵育，并在室温下以500g离心20分钟在感染后72小时收集。细胞颗粒被闪烁，并存储在-80°C下。
对于蛋白质纯化，将细胞沉淀在含有50 mM NAH2PO4 pH 7，300 mM NaCl，20 mM咪唑，10％甘油，1 mM TCEP，1 mM TCEP，250 U的苯并酶和完整的EDTA无EDTA无eDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒的裂解缓冲液中解冻。使用Dounce均质剂手动将细胞手动裂解，并在4°C下以14,000 rpm在14,000 rpm中在SS34转子中离心30分钟，然后使用5 µM，1.2 µM，1.2 µM和0.45 µM Acrodisc过滤器进行过滤。清除的裂解物使用iMac Buffer A（50 mm NAH2PO4 pH 7，300 mm NaCl，20 mm咪唑，10％甘油，10％甘油，1 mm TCEP）中的预包装的Histrap HP柱进行固定的金属亲和力色谱（IMAC）。The column was washed with 5 CV 10% buffer B (50 mM NaH2PO4 pH 7, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, 10% glycerol, 1 mM TCEP) and the protein was eluted applying a linear gradient over 10 CV to 100% buffer B. The fractions containing WRN were incubated with PreScission protease at 4 °C overnight.裂解后，将产物在50 mm Tris pH 7,0中以1：3稀释，甘油10％，并应用于预包装的HITRAP肝素HP柱上，以去除与WRN共划分的DNA。用2 CV载荷缓冲液洗涤色谱柱，并通过在25 CV中施加盐梯度从0％到100％洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7，10％M NaCl，10％甘油）的盐梯度从色谱柱洗脱。将含WRN的馏分汇总并浓缩至约5 mg ml-1，以进行结晶试验。将纯化的样品等分，闪光并存储在-80°C下。
所有结晶试验均在室温下使用坐式蒸气 - 扩散法进行。通过浸泡获得ATPγS复合物的晶体。通过在5 mg ml -1的情况下混合相等量（0.4 µL）的HWRN_MUT5，并含有20％PEG3350，0.2 M柠檬酸钠部落二氢酸钠的储层溶液来生长Apo晶体。将ATPγs与MGCL2一起溶解在2 mM浓度下，并将晶体浸泡过夜。在闪烁液氮中的晶体进行X射线数据收集之前，将它们放在含有30％甘油的储层溶液中，持续几秒钟。
使用坐式蒸气 - 扩散法在293 K的共结晶中获得了具有化合物3和HRO761的复合物的晶体。在50 mM Tris pH 7，〜300 mM NaCl和10％甘油中，HWRN_MUT6在5.4 mg ml -1中与抑制剂3或HRO761（DMSO中10 mM）混合，达到最终的化合物浓度为1 mm。将相等的蛋白质复合物和储层溶液的相等体积（0.4 µL）混合，并在室温下孵育板。使用30％Jeffamine ED-2001（汉普顿研究）和0.1 M HEPES pH 7作为储层溶液获得化合物3复合物晶体。HRO761复合物晶体使用25.5％PEG4000、0.17 m硫酸铵和15％甘油作为储层溶液生长。几天后出现单晶，并在含有20％甘油和10 mM抑制剂化合物的母液中浸泡10 s，然后在液氮中闪烁冷却以进行数据收集。
X射线衍射数据是在瑞士灯光源，光束线X10SA上收集的，并使用XDS/XSCALE36和AUTOPROC/Staraniso37,38工具箱进行处理（扩展数据表2）。Staraniso的分析表明，HRO761复合物的衍射数据是各向异性的，沿A*，沿A*，2.12Å沿B*和1.87Å的相互方向的衍射极限为1.86Å，沿C*。因此，该数据集是各向异性处理的，这解释了较低的球形完整性。通过用phaser39的分子替换来求解结构，用作搜索模型，以前求解了WRN内部结构的坐标。WRN的第一个内部结构是通过分子替换来求解的，作为搜索模型，已发表的BLM解旋酶结构（PDB：4O3M）的D1D2子域的坐标40。软件程序COOT41和BUSTER42用于模型构建和结构改进的迭代回合。复合结构的精制坐标已沉积在PDB上。数据收集和改进统计数据总结在扩展数据表2中。
启用人WRN-D1D2RH表达的DNA序列（Uniprot：Q14191，ASN517 – PRO1238），在氨基末端融合到其标签的末端融合，然后将ZZ TAG和HRV 3 C CLEAVAGE位点插入baculovirus转移量构成co-coletabalible co-ection veration Factryainsfection Facerainsfection interainsfection in tagection Facection Faction Factryainsfection inter。在SF21细胞中产生相应的杆状病毒库存，并根据无辛特的感染细胞保存和扩展规程（TIPS）43进行冻结。在27°C的SF21细胞中进行了大规模表达96小时。收集细胞并将其重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，1 mM TCEP，10％甘油，pH 8）中，并补充了完整的蛋白酶抑制剂片剂（Roche），苯并酶（Merck）（Merck）和20 mm咪唑。用乳液C3匀浆器（Avestin）裂解细胞。超速离心后，将裂解液加载到Histrap HP柱（Cytiva）上。在裂解缓冲液中用咪唑梯度洗脱结合的蛋白质。氨基末端HIS和ZZ标签在透析期间用HRV 3C蛋白酶裂解透析缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，1 mm NaCl，1 mM TCEP，10％甘油，0.02％CHAPS，CHAPS，pH 8）。人D1D2RH通过离子交换进一步纯化。将蛋白质加载到资源S离子交换柱（Cytiva）上，并在IEX缓冲液（20 mM Tris，1 mM TCEP，10％甘油，pH 7.0）中用NaCl梯度洗脱。作为最后一步，将蛋白质浓缩并加载到用SEC缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，10％甘油，pH 7.4）的SEC缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，10％）中进行预校准的SuperDex 200凝胶滤光柱（Cytiva）。将洗脱的靶蛋白浓缩并在干冰上冷冻。
DNA序列允许在氨基末端融合到他的标签上，然后将TEV裂解位点融合在氨基末端的人BLM-D1D2RH（Uniprot p54132：Lys640 – Gly1298）的表达。IPTG诱导后，在BL21（DE3）细胞中进行蛋白质表达。收集细胞并将其重悬于裂解缓冲液（50 mM NAH2PO4、300 mM NaCl，1 mM TCEP，20 mM咪唑，pH 8.0）中，并补充了2 mM MGCL2，苯甲酶和0.5 mM AEBSF。用乳液C3均质器裂解细胞。超速离心后，将裂解液加载到Histrap HP柱上。结合蛋白在裂解缓冲液中用咪唑梯度洗脱。用TEV蛋白酶裂解氨基末端标签。将切割蛋白加载在资源的离子交换柱上，并在IEX缓冲液中用NaCl梯度（20 mM Tris，1 mM TCEP，10％甘油，20 mM NaCl，20 mM NaCl，pH 7.4）洗脱。作为最后一步，将BLM-D1D22RH蛋白浓缩并加载到SEC缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，10％甘油，pH 7.4）的SEC缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，10％）中预校准的SuperDex 75凝胶滤光柱。将洗脱的靶蛋白浓缩并在干冰上冷冻。使用类似程序用于人类RECQ1-D1D2（UNIPROT：P46063，ASP62 – SER482）和人RECQ5-D1D2（UNIPROT：O94762，ASP11 – TRP453）蛋白质的表达和纯化。
总共9.8μLN末端AVI TAG-WRN（ASN517 – PRO1238），30 mm Tris-HCl PH7.5，1毫米MGCL2，30 mm NaCl，0.02％BSA，0.1％BSA，0.1％Plurononic F127与200 nl的Plarate F127孵育45分钟，在室内温度下为45分钟，室内温度为45分钟。781207）。然后，添加了10μLCy5标记的ATPγS（EDA-ATPγS-CY5，Jena Bioscience，NU-1609-CY5）和Europium标准的链霉亲素（Lance EU-W1024链霉亲素，Perkin Elmer，AD0063）。测定板中的最终浓度为15 nm WRN，10 nmATPγS-CY5和2 nm eu-streptavidin。使用Tecan Infinite M1000 Pro，在340 nm处激发欧盟，并在30分钟后在620 nm（F620）和665 nm（F665）下测量荧光发射。然后计算F665比665的比率，以确定每个孔中的FRET效率。在HIT优化期间使用该测定方案来构建初始结构 - 活性关系，并且还适用于1,536孔板以进行筛选。
我们使用ADP-GLO分析套件（Promega）监测ATP水解44。具有以下序列的45-寡核苷酸：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAAGTAAAAAAACGAGGGCCGCCAGTGC，称为FLAP26，如先前所述45，如先前所述45，是从IDT（Intemated DNA技术）购买的，并用作DNA底物。一个典型的反应由10 nm WRN D1D2RH（蛋白质构建体（ASN517 – Pro1238）），0.2 nm单链DNA（ssDNA）底物（KDNA）和15或300 µm ATP（20倍）ATP（20倍）（20倍km）组成。NaCl，在无DNase水中制备的0.1％Pluronic F127。为了确定IC50，从10 mm化合物溶液中制备了10个半木稀释液。然后，在384个小体积测定板（Greiner，784075）中，将每种浓度的50 nL预孵育3小时，并在600 µm ATP的测定缓冲液中，用20 nm WRN解旋酶蛋白在2.5μl。通过在0.4 nm处添加2.5μl的SSDNA底物，并在室温下孵育30分钟，从而开始反应。添加5μL的第一个ADP-GLO试剂并孵育1小时以去除过量的ATP，将反应停止。然后，添加10μl的ATP检测试剂并在阅读前再孵育一个小时。使用Pherastar读取器记录发光输出，在阅读前延迟了5分钟。在测定板中的重复项中测试了每个化合物的每个浓度。使用四参数Sigmoid Hill-Curve Model46确定复合效力（IC50值）。井的活性值归一化以抑制百分比（抑制百分比= [（高对照活性 - 样本活性）/（高对照活性 - 低对照活动）×100）×100），从每个板上的重复确定中进行IC50拟合。
与其他三种RECQ蛋白构建体一起使用了相同的ATPase分析方案，以评估WRN的选择性。进行时间课程实验，以确定每种RECQ蛋白的最佳酶法条件。如上所述，使用10 nm ssDNA底物，2 nm BLM蛋白构建体具有0.2 nm ssDNA底物和0.5 nm recq5蛋白构建体，分别用10 nm ssDNA底物和2 nm ssDNA底物进行实验。
我们使用了与先前所述的45染料略有不同的DNA底物。FLAP26寡核苷酸在3'中标记为ATTO647染料，并用TSUM25寡核苷酸退火，携带5'的BHQ3暗淬灭剂。选择了ATTO647/BHQ3对荧光染料/淬火器（激发620 nm，发射685 nm），以获得更好的测定鲁棒性和较低对化合物的干扰。然后，在30 mm Tris-HCl pH 7.5、0.5 mm MgCl2、50 mm NaCl，0.02％BSA，0.1％Pluronic F127和1 mM DTT中，用100 NL的100 NL化合物在房间温度下，黑色384-WELL PLATES（GRATES-GIOENER BIOENEREBONE）在45分钟内孵育4.1％pluronic F127和1 mm DTT，4.9μlWRND1D2RH在3.5 mm mgcl2，0.5 mm mgcl2、50 mm NaCl，0.02％BSA，0.1％。接下来，添加了5μl含有ATP，双链DNA（DSDNA）的溶液，如上所述，添加了TRAP SSDNA TSTEM01以启动反应。最终测定浓度为0.5 nm WRN（D1D2RH），300μMATP，50 nm dsDNA和100 nm TRAP SSDNA（GCACTGGCCGCGTCGTTTTTACG）。使用Tecan Infinite M1000 Pro系统，随着时间的推移监测了DNA解开后荧光的增加。激发和发射波长分别设置为647 nm和669 nm。
在30 mm Tris pH 7.5，30 mm NaCl，1 µM MGCL2，0.02％BSA，0.1％Pluronic F127中，总共有20μLN末端AVI TAG-WRN蛋白（ASN517-PRO1238），含有proptna的浓度较高，含有五倍的浓度，在含有五倍的浓度上，protife f127 p ph 7.5，30 mm naCl，1 µm mgcl2，0.02％bsa，0.1％pluronic f127。6（扩展数据图2F）在室温下持续1小时。然后，添加了10μL链霉亲和素涂层的PVT闪烁接近测定（SPA）珠（Perkin Elmer，RPNQ0009），并在TopCount Luminence读取器中读取30分钟后读取板（1分钟，1分钟，延迟，每孔1分钟）。最终的测定浓度为10 nm WRN，50 nm dsDNA（对于DSDNA的条件），图中所示的放射性物体浓度范围和PVT Spa珠子的每孔50μg。dsDNA与DNA无通用测定法（无标签）中使用的底物相同。
所有细胞系都是原始癌细胞系百科全书的一部分，如先前所述处理1。补充表6中描述了细胞系培养基和起源。所有模型均经常测试，以免没有支原体，并通过SNP基因分型验证其身份。HCT116 TP53 - / - 细胞是从Horizon购买的（D104-001）。使用标准CRISPR技术生成DLD-1 WRN-KNOCKOUT细胞，并从Genscript AgcatcgaactatacaCaa47产生以下SGRNA序列。从韩国细胞系库中获得了WRN敲低不敏感的结肠癌细胞系DLD-1（RRID：CVCL_0248），用于生成衍生物，在该导数中，使用标准CRISPR方法通过CRISPR介导的介导的内源性WRN基因被淘汰了内源性WRN基因。根据与诺华的物料转移协议，可根据要求提供该单元线。HCTT116 cells with a knock-in of alanine instead of cysteine at position 727 of the WRN protein were generated using standard CRISPR techniques and the following sgRNA sequence for cutting AATCTCAGATCACCTGTAC, and the following ssDNA sequence as a donor GGAAAATCGTTCTAAATCTAATCTCAAAACACAAAAACAAATTCGAAA, both from Genscript.根据与诺华的物料转移协议，可根据要求提供该单元线。在WRN蛋白的位置727处使用丝氨酸而不是半胱氨酸的RKO细胞是通过Horizon Discovery Limited使用X-MAN技术在项目编号CLPP775下生成的。该单元线可从Horizon Discovery获得。所有细胞均在37°C下保持在加湿的5％CO2孵化器中。
从Cellecta订购了shRNA构建体到PRSI-U6-TET-CCDB诱导载体系统。SHRNA WRN目标序列是对应于WRN基因进入NM_000553.6的CCTGACTCCAGGGTTCAGAA。非靶向控制shRNA序列是ggataatggtgattgagatgg。将WRN野生型和点突变剂的cDNA表达构建体合成为shRNA耐药性（DNA2.0）的密码子优化cDNA（DNA2.0），并将其克隆到由CMV启动子（PD2528-CMV）驱动的慢病毒cDNA表达载体中。
将HEK293FT细胞用含有1 µg质粒的混合物和1 µg慢病毒包装质粒混合（Cellecta，MSPPCPCP-K2A）转染20分钟，并用Transit-LT1转染试剂（Mirus，NovSMIR2300）预孵育20分钟。将转染的HEK293FT细胞在37°C下孵育48小时，并使用0.45 µM注射器过滤器收集含有慢病毒的上清液。通过用含有8 µg ml-1的聚紧氢终浓度（Merck，TR-1003-G）的新鲜培养基（Merck，TR-1003-G）的新鲜培养基（TR-1003-G）离心进行细胞感染。感染后48小时，用1 µg mL -1的嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific，A1113803）用于shRNA构建体，或10 µg ml -1 blasticidin用于救援构建体。确保模拟死亡后，使用细胞进行进一步的实验，并使用多西环素（Sigma-Aldrich，d9891）使用100 ng ml-1终浓度诱导SHRNA表达48 h。
将细胞用化合物3处理24小时，然后用冰冷的PBS洗涤它们，并在冰上使用400 µL尿素裂解缓冲液（8 m尿素和50 mM Tris pH 8.4）裂解，并在-80°C下储存直至进一步处理。用5 mM DTT降低相当于100万细胞的细胞裂解物，用10 mM碘乙酰氨酰胺烷基化1小时，最后用10 mM DTT淬灭15分钟。所有步骤均在室温下执行。随后，将细胞裂解物稀释至2 M尿素，并将胰蛋白酶/Lys-C混合物（Promega）添加到酶与蛋白质比为1:50的蛋白质比，然后在37°C下过夜孵育。根据制造商的说明，将所得的肽混合物在1 mL Seppak柱（水）上脱盐，并使用TMT 16-Plex试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行干燥和标记。验证完整的TMT标记后，将样品合并并使用高pH反相色谱分离为24个串联分数。然后，使用基于MS3的工作流48分析了24个级分48在Orbitrap Fusion Lumos LCMS系统（Thermo Fisher Scientific）上使用3 h梯度进行TMT定量。使用蛋白质组发现者2.4（Thermo Fisher Scientific）分析原始数据。为了定量，对每种蛋白质的独特肽强度进行了求和，并比较了样品之间的中值蛋白强度。由于在三种敏感细胞系中的异源蛋白水平，配对的t检验（如Python Scipy包中实现）被用于计算DMSO处理的与化合物4处理的细胞之间的显着差异。
在各种癌细胞系中评估了抑制细胞增殖和存活的能力。通过steriflip-NY0.22μm滤光片（Millipore，SCNY00020）过滤后，将胰蛋白酶化的细胞以每孔500–8,000的细胞接种到白色，透明底板96孔板（Costar，3903）中。为每个化合物处理条件准备了三个复制板。此外，准备一块板（称为第0天），以量化化合物添加时的活细胞数量。在37°C孵育过夜后，在加湿的5％CO2大气中，使用A HP 300D非接触数字数字分配器（HP）直接将给定化合物的八个三倍连续稀释（以DMSO的浓度为10 mm，在4°C下以4°C的浓度获得）。在所有井中，DMSO的最终浓度均标准化为0.1％。然后，加入复合后的96小时，在添加50 µl CellTiter-GLO（Promega，g7573）试剂后，评估了细胞ATP水平作为细胞生存力的替代水平，并在室温下进行10 min孵育后，在协同的HT多模式板读取器（Biotek）上对协同的HT多模式板读取器（Biotek）进行了发光定量。在复合当天，第0天板中生存的细胞数量相同。为了进行数据分析，在进一步计算之前，从所有其他数据点中减去了在包含培养基但没有单元的井中确定的测定背景信号。通过比较化合物处理的细胞中的ATP水平（使用CellTiter-GLO，Promega测量的ATP水平）与化合物添加时存在的细胞中的ATP水平（使用CellTiter-GLO，Promega测量）评估了生长抑制和潜在细胞杀伤的程度。为此，在Helios中使用以下条件概念，该概念是在Helios中应用的，Helios是一种应用多步骤决策树的内部软件，以达到最佳浓度响应曲线拟合46，以计算每个化合物处理的每种化合物的百分比增长（％g）：％g =（t-v0）/v0）/t <v0，t <v0，t <v0，t <v0，t <v0，t <v0，t <v0，t <v0） 和％g =（t-v0）/（v-v0）））×100当t≥V0时，其中V0是化合物添加时V0是可行性水平，而V and T分别代表了载体控制和化合物处理的可行性水平，在化合物孵化的末端。100％，0％和-100％分别表示没有生长抑制作用，生长停滞和完全杀死细胞。常规计算出最高测试化合物浓度（数据（CMAX），以百分比表示）的化合物浓度和残留细胞活力。还可以使用旨在使用四参数拟合（例如GraphPad Prism，XL Fit）来得出IC50值的市售软件进行数据分析。报告的GI50值是至少两个独立重复的几何均值。对于在Horizon发现（地平线-2D Oncosignature面板）中介绍的301个细胞系，HRO761的抗增殖活性通过Horizon的定制药物筛查服务评估了5天的Celltiter-Glo细胞生存能分析。生长抑制（GI50）指标是从适合实验数据点的剂量 - 反应曲线得出的，这些曲线捕获了对HRO761的敏感性，相对于DMSO载体控制在9点稀释范围内，最高为10 µm）。
在第1天，将细胞胰蛋白酶素化，重悬于相应的培养基中，并使用Bio-Rad的TC20细胞计数器进行计数。将细胞在每孔3,000至4,000个细胞中的200μl生长培养基中播种，中透明底板（Corning Cat，3903）。在第2天，将细胞在37°C的37°C下孵育过夜，并使用HP 300D非接触式数字分配器（Tecan）与指定浓度一式三份处理。在所有井中，DMSO的最终浓度均标准化为0.1％。在实验的第7天，通过抽吸和添加新鲜培养基仔细去除培养基，然后在第2天进行复合给药，从而刷新化合物治疗。通过仔细吸入培养基，用新鲜的培养基清洗并添加200 µL新鲜培养基，从而消除了复合处理。在第21天左右，通过仔细吸收培养基并添加200 µL新鲜培养基来刷新培养基。监测实验，并使用Incucyte S3 Live细胞分析仪器（Sartorius）获取图像。从第2天到40天，每6小时一次捕获图像。使用GraphPad Prism分析并表示数据。
将细胞以每孔250-2,000个细胞在1 ml培养基中的12孔板中播种。以10 µm的起始浓度添加HRO761。在37°C的过夜孵育中，在加湿的5％二氧化碳气氛中，使用HP 300D非接触数字分配器（Tecan）直接将给定化合物的十三倍连续稀释（以DMSO的浓度为10 mm，在4°C下以4°C的浓度获得）。在所有井中，DMSO的最终浓度均标准化为0.1％。将细胞放在孵化器中8-20天，每3-4天进行中等交换。此后，直接在每个测试中直接添加100 µL甲醛37％，并在室温下孵育15分钟。用5 mL水冲洗两次后，在室温下加入0.5 ml 0.05％的亚甲基蓝色。将井用水冲洗三次，将1 ml的3％HCl添加到板上并摇动直至完全溶解。在96孔板中将总共200 µL转移到96孔板中，并使用微滴定板读取器（Synergy HT）在650 nm处测量吸光度。使用XLFIT使用剂量响应One位点模型201计算导致一半最大生长抑制（GI50）的化合物浓度（GI50），fit =（A+（（b - a）/（1+（1+（（x/c）d）d））））。对于非粘附细胞系，在添加200 µL CellTiterGlo（Promega，g7573）试剂后，评估了细胞ATP水平作为细胞生存力的替代物，在去除600 µL后将其用于培养物。在室温下孵育15分钟后，在Synergy HT板读取器上进行发光定量。分析了甲基蓝色染色的数据。
将细胞裂解在NP-40裂解缓冲液（0.05 m Tris HCl PH 7.8、1％NP40、0.12 M NaCl，0.025 M NAF，0.04Mβ-甘油磷酸二钠钠钠盐）中补充了完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，04906833737001），04693124001）。将裂解物分离在4–12％的BIS-Tris凝胶（Bio-Rad）中，然后将其转移到硝酸纤维素膜（Amersham，10600002）中，并用5％脱脂牛奶（Sigma-Aldrich，70166-500）在1×PBS中堵塞1小时。用于免疫印迹的主要抗体和稀释液如下：ATM（细胞信号技术，2873，1：1,000），PATM SER1981（ABCAM，ABCAM，ABCAM，ABCAM，1：1,000），CHK2（Cell Signaling Technology，3440，1：1,000，1：1,000），PCHK2 THR68（PCHK2 THR68（PCHK2 THR68）（PCHK2 THR68）（1,000）OP43，1：2,000），P21（细胞信号技术，2947，1：2,000），WRN（Millipore，Mabd34，1：1,000），actin（Chemicon，Mab1501，1：10,000），PH2AX SER139或γH2AX（细胞信号技术）1：1,000），PKAP1 SER824（细胞信号技术，4127，1：1,000），PAR THR1989（细胞信号技术，30632，1：1,000），MDM2（CalbioChem，Op46，1：1,000），Tubulin（sigma-aldrich，sigma-aldrich，t9026，1：1：1：1：10,000），puma，1：10,000）1:1,000), SP1 (Cell Signaling Technology, 9389), phosphorylated histone H3 (Cell Signaling Technology, 9706), cyclin E (Upstate, 06-134), cyclin A (Sigma-Aldrich, C4710), cyclin B1 (Cell Signaling Technology, 55506), goat anti-rabbit (Cell Signaling Technology, 7074, 1:5,000),山羊抗小鼠（细胞信号技术，7076，1：5,000）。将膜与原代抗体一起孵育过夜，并与二抗体一起孵育1小时。用1×PBS进行洗涤步骤，其中包含0.01％Tween-20。使用ECL底物（Advansta，K12045-D20）和FEMTO底物（Thermo Fisher Scientific，34096）进行了开发，并在FX FX设备（WITEC）上进行。 使用EvolutionCapt软件。除了图2所示的印迹外，我们进行了三次免疫印迹。2E和4C以及扩展数据图。6B和8F，两次进行。显示了一个实验的代表性结果。所有印迹的无工艺和未经处理的扫描都可以作为补充无花果。1（包含图2D，E，3A，G和4C和2的主要文本图）和2（扩展数据图。
将细胞培养在225 cm2烧瓶（Falcon，353138）中，最大汇合度为95％，然后在PBS中将细胞冲洗两次，并以12.5 ml的裂解缓冲液为每个烧瓶（50 mm Tris Tris pH 7.8，1.8，1％Np40）（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，744385），120mmMA，120mmMMMMA，120mmMMMMMMA，71380), 25 mM NaF (Merck, 1.06450.0025), 40 mM β-glycerophosphate disodium salt (Sigma-Aldrich, 50020), 100 µM sodium metavanadate (Sigma-Aldrich, 590088), 1 mM DL-DTT (Sigma-Aldrich, 43815), 100 µM phenylmethyl亚磺氟氟化物（Sigma-Aldrich，P-7626），1 mm苯甲酰胺（Sigma-Aldrich，B-6506），1 µM微囊蛋白（Alexis Biocyicals 350-012-M001））。将裂解液在4°C下离心10分钟，并定量总蛋白并调整为0.5 µg µl -1。然后，将100 µL的细胞裂解液铺在96孔板中，使用HP分配器（软件D300ECORTOL）在10 µm开始用HRO761处理裂解物，然后在20°C下孵育72小时。孵育后，如下所述，将板用于WRN酶联免疫吸附测定（ELISA）分析。PS50值是在DMSO对照中稳定WRN蛋白50％所需的HRO761水平。
补充表2中提供了所有抗体的列表。将Maxisorp板（NUNC，437111，Thermo Fisher Scientific）涂上，每次稀释的PBS中的50 µL主抗体，并在室温下孵育2小时。将板在PBS中洗涤，每孔添加了200 µL（PBS，0.05％Tween-20，5％脱脂牛奶），并在室温下孵育至少2小时。洗涤板，并加入50 µL HRO761处理的裂解物（来自蛋白质稳定化测定法），并在室温下孵育2小时。然后洗涤板，并在封闭缓冲液中稀释50 µL二级抗体，并将板在4°C下孵育过夜。第二天，每孔缓冲液添加50 µL三级抗体，并在室温下孵育2小时。在用200 µL PBS搭配0.05％Tween-20并用水一次洗涤台阶后，然后用100 µL等体积的SuperSignal Elisa picoluminol增强剂和Supersignal Elisa Pico稳定的过氧化氧化物溶液（Thermo Fisher Scientific，37069）进行检测。摇动板，并立即在协同HT微孔板读取器上检测到发光。
用RLT缓冲液（QIAGEN）从SW48细胞中提取总RNA，该细胞以450,000个细胞在六孔板中处理的450,000个细胞，在指定浓度下24小时。根据制造商的说明，使用Rneasy Mini Kit（Qiagen，74106）和Qiashredder列（Qiagen，79656）进行萃取。使用纳米体（Thermo Fisher Scientific）设备测量总RNA浓度，并将20 ng用于RT -QPCR反应。
使用前，使用ITAQ通用探针一步试剂盒（Bio-Rad，1725141）在使用前使用储存在-80°C下的RNA样品进行了一式三份的ITAQ通用探针（Bio-Rad，1725141）进行了反应。使用了一项多重协议，并从IDT（https://eu.idtdna.com/）订购了用于RT – QPCR分析的TAQMAN探针，作为限定的黄金时段QPCR探针测定，标记为FAM/ZEN/IBFQ，所有fam/Zen/ibfq除外，除了家政/Zen/Zen/Zen/Zen/Zen/Zen/Zen/ibfq（除外）。简而言之，在超铜水中以10 ng µl-1归一化的RNA（Invitrogen，10977-035）与8 µl的2×主混合物混合如下：ITAQ混合5 µl，5 µL，0.25 µL Iscript RT，0.25 µL TAQMAN概率，用于基因的0.25 µl TAQ MENE，0.25;2 µL超纯水。7900HT设备（Applied Biosystem）的协议包括50°C的10分钟步骤；在95°C下灭活3分钟；40在95°C下10 s的变性循环和60°C的30 s杂交/伸长步骤。根据ΔΔCT方法49计算了mRNA表达的相对水平，并将单个表达数据标准化为ACTB。通过SYBR绿色测量WRN内源性与WRN外源K577a突变体mRNA。如上所述分离RNA后，使用高容量性cDNA逆转录试剂盒用初始量250 ng的RNA进行RT（Applied Biosystems，4368813）。The qPCR reaction was performed using SYBR green (Applied Biosystem, 4367659) mixed with 5 ng of cDNA and primer pairs (WRNendogenous forward: GTCATGGCAACTGGATATGGA, WRNendogenous reverse: CTGGAGCAGGCCCATGTTAC, WRNK577A forward: AGGAAAGACGGGACAACGTC, WRNK577Areverse:根据供应商的建议，CGTCGACGGCAATCAGAGAGTA）。QPCR反应和解离曲线已在应用的生物系统7900HT设备上运行。用于分析的软件为SDS2.4.1，手动调整计算阈值，并使用ΔCT方法分析所得数据：对于每个样本， 为每个感兴趣的基因（以及参考基因（人ACTB）进行了三种重复。计算每组三次三份的平均值和s.d.。每个样本的ΔCT计算为感兴趣基因的ct的差异，而对给定样品的参考基因的CT差异。给定样品的参考基因。此差异的s.d. s.d. s.d. s.d s.d e s. necte nement syture sepect n syst sem n sythe sem sepect sy n gresed sem n gresed s. sep s nythe n n gresed sepred n gresed s. sepred n gresed S.D. s.d.感兴趣的样本（例如，已处理的样品）（媒介物处理的样本与先前的S.D相同）。非线性）然后将结果归一化，将平均车辆值设置为1.0或100％。
如上所述提取RNA，唯一的变化是根据制造商的说明（无RNase DNase Set，79254）进行的。根据制造商的说明，使用RNA屏幕磁带（5067–5576，5067–5578，5067–5577）分析了RNA浓度和完整性。使用Truseq绞合的mRNA库预备套件（Illumina，20020595）以及Hiseq 4000或Illumina的Novaseq 6000仪器进行RNA-Seq。
双鱼座管道50（V.0.1.3.1）用于量化基因级表达。所有进一步的分析均使用R（V.4.2.1）统计软件进行。使用DESEQ2（参考文献51）进行了两个条件（治疗和对照）之间的差异基因表达分析（V.1.36.0）。使用Benjamini -Hochberg程序校正了所得的P值进行多次测试。运行基因集富集分析（GSEA）以测试WRN敲除后每个细胞系中向上或下调的基因集。特别是，我们使用R软件包FGSEA52（v.1.25.1）来估计Hallmark Collection中设置的每个基因（H.All.v6.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.symbols.gmt）从分子签名数据库中估算标准化的富集统计量和相关的P值，该基因具有NPERM = 10,000的分子签名数据库53。
对于核γH2AX染色，将细胞在96孔板中播种（Cellcarrier-96 Ultra胶原蛋白涂层Perkinelmer，6055700），每100 µL 105个细胞每孔每孔每100 µL，并在37°C下孵育18小时。使用HP分配器对HRO761进行处理。复合暴露后，将细胞固定在室温下在PBS中的4％（v/v）多聚甲醛（PFA）固定10分钟，用PBS洗涤两次，用PBS洗涤两次，并用0.5％（v/v）Triton X-100，在室温下PBS 0.5％（v/v）Triton X-100，0.5％BSA。然后将细胞与1：2,000抗γH2AX（Millipore，05-636）的原代抗体在4°C隔断过夜。然后将细胞用PBS中的0.5％（v/v）Triton X-100洗涤3次，然后与1：2,000山羊抗小鼠Alexa Fluor 488偶联的抗体（Invitrogen，A11001）和1 µg ML-1 DAPI在室温下在室温下1 h中孵育。然后将细胞用0.5％（v/v）Triton X-100洗涤3次，并在成像之前最终将200μlPBS洗涤。使用Perkinelmer Opera Phenix Imagy Imager和Harmony 4.9软件捕获和分析图像。
通过胰蛋白酶收集约2×106的细胞，并用PBS洗涤一次。在室温下将细胞沉淀并固定在100 µL 4％甲醛（Sigma-Aldrich，47608）中15分钟。通过离心以超过1×PBS的离心洗涤细胞。将颗粒重悬于100 µL 1×PBS中，然后将900 µL冰冷的甲醇（Sigma-Aldrich，34860）通过涡旋时滴下滴。将细胞在冰上孵育10分钟，以将其透化。通过离心以超过1×PBS的离心洗涤细胞，将颗粒重悬于100 µL抗磷酸化的抗磷酸化的H3 SER10中，将其缀合至PE（细胞信号技术，5764）抗体在0.5％BSA PBS缓冲液中稀释1:50，在室温下在室温下孵育1 h，在0.5％的BSA PBS缓冲液中均能孵育。通过离心两次以超过1×PBS的离心洗涤后，将细胞用3 µM终浓度的DAPI溶液（Thermo Fisher Scientific，62248）染色为1-5分钟，以保护光。通过离心两次，用超过1×PBS洗涤细胞。在细胞流式细胞仪（Beckman Coulter）上分析染色的细胞。
在105个粒子单元中收集数据，并用Cytexpert v.2.4软件进行分析。基于正向散射面积（FSC-A）和侧散射区（SSC-A）特征，排除了细胞碎屑和死细胞。随后，基于FSC-A和正向散射高（FSC-H）曲线鉴定了单元。然后，分析了这些单重血的DAPI（DNA含量）和PE（磷酸化的组蛋白H3 Ser10）染色强度。分析了数据，以显示使用DAPI通道在G1，S和G2/M相中的核的百分比，并使用PE通道在G2或M相中专门在G2或M期中的细胞百分比。
用2 mM胸苷溶液（Sigma-Aldrich，T1895）将细胞封闭18小时。然后通过用PBS洗涤释放细胞，然后添加完整的培养基并孵育9小时。然后，再次加入2 mM胸苷溶液15小时。接下来收集细胞（T = 0 h），然后用PBS洗涤并添加完整的培养基。每2小时收集一次细胞，直到12小时。对于M相控制，将非同步的细胞用330 nm的Nocodazole（Sigma-Aldrich，M1404）处理18小时。
如图所示，将总共6×106细胞铺板并处理。根据制造商的说明，使用FOXP3/转录因子染色缓冲盒（Thermo Fisher Scientific，00-5523-00）处理细胞，并如上所述由Western Blot运行的样品。
所有动物研究均根据kantonalesveterinäramtbasel-stadt发布的伦理和程序进行，并严格遵守Eidgenösissischestierschutzgesetz和EidgenösissCheUtchutnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnungnung，所有动物研究均由内部伦理委员会批准。所有动物都可以随意获得食物和水，并被带有反对物。它们被安置在IVC架子架上的特定无病因的设施中，在12 h – 12 h的光线周期中。为了建立细胞系衍生的异种移植模型，为6-7周龄的女性无裸裸（CRL：NU（NCR）-FOXN1NU）或SCID-BEIGE（CB17.CG-PRKDCSCIDLYSTBG-J/CRL），来自Charles River的小鼠在Charles River中施加了500万Tumor charles in Charles River的小鼠（s）。对于SNU-407，LOVO，IM95，RL95.2，ISHIKAWA和IGROV-1，将细胞浓缩在50％Matrigel（354234，Corning）中。如前所述54，通过移植诱导并扩大了患者来源的异种移植物。将HRO761的无定形钠盐溶解在20％的水中羟基丙烷-beta-cyclodextrin中。对于疗效实验，将小鼠随机分为组（n = 5-6），平均肿瘤大小为100-150 mm3。对于SW48模型，HRO761每天以多剂量的多剂量口服每公斤120 mg，直到复发。在第7和第91天收集了血液样本。对于其他CDX和PDX模型，HRO761每天以每公斤60或120 mg的速度给予HRO761，持续3-4周。据报道，肿瘤反应是通过治疗开始的肿瘤量的度量。对于含SW48肿瘤小鼠的PD实验，HRO761每天以每公斤20或60 mg的速度进行口服饲养。动物是随机的（n = 3），并在第一天的0、1、4、8和24小时收集肿瘤样品，然后在第3、8、10、14天进行最后一次处理后4小时收集了肿瘤样品（包括24 h TimePoint），17和21。 在固定后，用冷冻REOPREP系统（CP-02，Covaris型）冷冻在液氮和低温干燥的情况下粉碎。对于SW48模型中化合物3的功效实验，将小鼠的平均肿瘤大小随机分为组（n = 7），每公斤15、50和150毫克的肿瘤大小为〜200 mm3，持续13天。在第12天，收集血液样本进行PK分析。在最后一天（最后一次治疗后3小时），切除，称重，在液氮中冷冻，冷冻干燥干燥，以进行PD分析。对于SW48模型中的组合实验，将小鼠的平均肿瘤大小随机分为组（n = 5），约为170 mm3，并用HRO761以每公斤20 mg的hro761口服治疗一次，或每周静脉内每周静脉内静脉注射一次，以每千克60毫克的静脉内静脉注射，或者每千克的组合，或hro761的组合与15 kg ryot s in IriNOT降低iriNOT，则为irinot in Irinot in Irinoot n irinot n irinot n irinot。
用乙腈提取血液样品，并使用空白血液中的内部和正宗标准来确定使用UPLC -MS/MS的化合物3浓度。通过非室内分析确定PK参数。小鼠，大鼠和狗的静脉注射剂研究分别以每公斤1、1和0.1 mg的速度进行（扩展数据表1）。
Formalin-fixed paraffin-embedded sections were stained on a Leica Bond RX using the Opal 7 colour Automation IHC detection kit (Akoya Biosciences, NEL871001KT) and Opal Polymer anti-rabbit HRP kit (Akoya Biosciences, ARR1001KT) according to the manufacturer’s instructions with epitope retrieval 1 (ER1) conditions for在100°C下20分钟。对于免疫组织化学染色，使用补充表4中描述的抗体评估了WRN和PCHK2。使用Halo（Indica Labs）的核大小评估进行了肿瘤细胞中的核大小评估，该抗体（INDICA LABS）的STonUCLEAL IHC算法通过细胞对单染色的细胞化学效率来测量细胞的细胞阳性。为了进行免疫荧光分析，对DDR对治疗的反应（PCHK2，P21和γH2AX），肿瘤含量（PAN-CK）和肿瘤细胞增殖（KI-67）使用耦合的抗体与特定的蛋白质染料耦合在补充表5中列出的序列中所述的序列中所述的prift 30。允许在×20放大倍率上扫描在苯imimager HT多光谱成像系统（Akoya Biosciences）上的放大倍率。
除了图2所示的印迹外，所有免疫印迹重复了3次。2E和4C以及扩展数据图。6B和8F，两次进行。显示了一个实验的代表性结果。
对于图4D，图片代表了一项研究和动物，每组中有三只动物，而SW48中的时间点则代表了三只动物，但是对不同的结直肠癌msihigh Xenograpt和PDX模型进行了相同的观察结果。
对于扩展数据图1F，图片代表了一项研究和动物，每组，状况和时间点有三只动物。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。