没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。
该研究符合所有相关的道德法规和准则。从所有人类参与者那里获得了知情同意，并包括同意书发布图中包含的照片。通过纽卡斯尔（Newcastle）在泰恩医院NHS基金会信托基金会，人类发育生物学资源（HDBR，https://www.hdbr.org）或Addenbrooke医院，与R. A. Barker合作的剑桥。胎儿样品的采购和研究已获得REC18/NE/0290- IRAS项目ID：250012，东北 - 纽卡斯尔和北泰恩赛德1研究伦理委员会和Rec -96/085，英格兰以东 - 剑桥中央研究伦理委员会。
作为伦理批准的研究研究的一部分，在父母和/或患者的知情同意下获得了肠道类器官培养的儿科患者材料（Rec-12/ee/0482，英格兰，赫特福德郡东部，赫特福德郡和rec-17/ee/0265- ier/0265- iras Project ID委员会ID：2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222.22222222222222222222222.222907，
在道德批准后，由已故移植器官捐赠者的剑桥生物座位（参考文献15/ee/0152，英格兰东部 - 剑桥南方研究伦理委员会）获得了人类成人组织，并获得了捐助者家族的同意。包括捐助者年龄和性别的详细信息作为补充表2。从11个不同的位置收集样本，包括十二指肠（两个位置，二人组和二人组合），在分析中汇总），jejunum（jej）（jej）（jej），ileum（两个位置，ile1和ile2和ile2 col co co co ca ca ca cae cae ca）（ca），cae cae cae cae cae，ca）（AP）（ap），ca），catendix（ap），D.（ACL），横向结肠（TCL），降结肠（DCL），Sigmoid结肠（SCL），直肠（REC）和肠系膜淋巴结（MLN）。在循环停滞后1小时内切除了新鲜的粘膜肠组织和淋巴结。在威斯康星大学的器官保护溶液（Belzer UW冷藏解决方案；生命桥梁）中保存肠道组织，并在4°C下存储在盐水中直至加工。在组织检索2小时内进行组织解离。
C57BL/6小鼠是从杰克逊实验室获得的，并在剑桥大学的家庭办公室批准的设施中保持在不含病原体的特定条件下。使用了10-14周的雌性小鼠；所使用的小鼠的数量包括在相关的图例中。所有程序均根据1986年《英国动物法》（Scientific Prosistional Act）制定，并由剑桥大学动物福利和道德审查机构批准。
切割胎儿肠外肠以延长组织，并将肠道剖析成近端回肠（PIL），中回肠（MIL），末端回肠（TIL），结肠或大肠或大肠（LI）和附录。除附录外，样品用汉克斯缓冲盐水溶液（HBSS； Sigma-Aldrich，55021c）洗涤两次，并使用手术刀将其切成碎片。将样品孵育在2 mL HBSS溶液中，其中含有0.21 mg ml-1 liberase TL（Roche，5401020001）或DH（Roche，5401089001）和70 U ML-1透明质酸酶（Merck，Merck，385931-25KU），每个1分钟均在37°C中，均为37931-25KU）移液器。单个细胞通过40–100μm筛子，并在400克4°C下向下旋转10分钟。根据制造商的指南，使用红细胞裂解溶液（EBIOSCIECE10X RBC裂解缓冲液（多物种））去除红细胞，并通过400G在400g的4°C下在400g的FACS缓冲液（1％（v/v）FBS（1％（v/v）FBS）中收集其余细胞。所有肠道区域样品（MLN除外）通过磁性细胞分选（MAC）进行富集。
在用冷的D-PBS（Gibco，14190094）洗涤之前，将成年组织切片称重，并用手术刀切成丁。将样品分离为1-2 mL的消化混合物（D-PBS，250 µg ml-1 liberase TL（Roche，5401020001），0.1 mg ml-1 dnasei（Sigma，11284932001））或DH（Roche，5401089001）和70 uml-1 Hyarnic（Roche）385931-25KU）在37°C下最多30分钟。然后通过70μm细胞过滤器通过消化的裂解物，然后通过10 mL中和培养基（rpmi 1640培养基（Gibco，42401042），20％（v/v）FBS（Sigma，25200-056））。然后将样品在4°C下以700克离心5分钟。将细胞重悬于D-PBS中的1 mL 0.04％（w/v）BSA中，并使用Nucleocounter NC-200和Via1-Cassette（Chemometec）进行计数。所有肠道区域样品（MLN除外）都进行了MAC富集。
MAC富集具有大于500,000的细胞产量的样品。将离解的细胞在4°C下在300g下离心5分钟，并重悬于80μl冷水Mac缓冲液中（D-PBS，0.5％，0.5％（w/v）BSA（Sigma-Aldrich，A7906-10G），A7906-10G），2 mm EDTA（Thormo Fisher，15575020））130-045-801），在4°C下孵育15分钟。用2 mL MAC缓冲液洗涤细胞，并按照上述离心，并重悬于500μlMac的缓冲液中。细胞通过Quadromacs磁细胞分离剂（Miltenyi Biotech），通过预润湿的MS柱（Miltenyi Biotech，130-042-201），然后在500μLMacs缓冲液中进行四轮。流通量作为CD45-馏分收集。从磁铁中除去色谱柱，并用1 mL MAC缓冲液洗脱CD45+分数。将CD45-和CD45+级分离上述离心，并在D-PBS中重悬于0.5-1 mL 0.04％（w/v）BSA中。使用Nucleocounter NC-200和Via-Cassette（Chemometec）或血细胞计确定细胞计数和生存能力，并在D-PBS中重悬于0.04％（w/v）BSA中。胎儿CD45+和CD45-分数以1：1的比例合并。
在Matrigel（Corning）中培养了来自小儿患者的肠癌。在器官培养期间，每48-72小时更换培养基。使用P1000移液管的机械破坏将器官传递，并在新鲜生长因素减少的Matrigel（Corning）中重新种子。比较培养基时，从单个解离样品中播种了多个井。然后，将类器官生长5天，然后在40 ng ml -1或以20 ng ml -1处在40 ng ml -1或IFNγ（PHC4031，LIFE TENCEISIES）下用重组人蛋白TNF（H8916，Sigma Aldrich）处理24小时。通过在分化培养基49中培养，然后在体外分化器官4天，然后收集以进行RNA提取。使用EVOS FL系统（Life Technologies）拍摄了明亮场图像。
通过在4°C下与细胞恢复溶液一起在4°C下孵育20分钟，将细胞固定，对细胞进行孵育，然后在Tryple酶溶液（Thermo Fisher）中重新悬浮，以在37°C的37°C孵育10分钟，从而在第3-4通道中除去Matrigel的类器官，以进行单细胞测序分析，以进行单细胞测序分析，以进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，进行单细胞测序分析，则将单细胞测序分析进行处理。再次将细胞沉淀并在DMEM/F12中重新悬浮。
用Genelute哺乳动物总RNA微型RNA试剂盒（Sigma）提取总RNA，并使用定量逆转录试剂盒（QIAGEN）对1 µg RNA进行反转录。互补的DNA与5 ng RNA相对应的互补DNA用于7500快速实时PCR系统上的Quantbr Green PCR主（Qiagen）进行实时PCR，7500 Software v.2.0.6（由Thermo Fisher Scientific Applied Biosciences）。特定目标扩增的引物为：FCGR2A FWD 5ʹ-CCATCCACAAGCAAACCACACAC-3ʹ和REV 5ʹ-AGCAGTCGCAATGACCACACACAC-3ʹ；FCGR2B FWD 5ʹ-CCATCCACAAGCAAACCACAG-3ʹ和Rev 5ʹ-Acagcaatcccagtgaccacag-3’;PLCG2 FWD 5ʹ-AACCCATCTGACCCTCTCTTG-3ʹ和REV 5ʹ-agactgctgttcctgtgtgtgttcc-3ʹ;POU2F3 FWD 5ʹ-TTCAGCCAGACCACCATCTCAC-3ʹ和Rev 5ʹ-GgactctCatgCatCattCattCagccac-3ʹ;MUC2 FWD 5ʹ-GATTCGAAGTGAAGAGAGAAG-3ʹ和REV 5ʹ-CACTTGGAGGAATAACACTGG-3ʹ;LGR5 FWD 5ʹ-CTCCCAGGTCTGGTGTGTGTGTG-3ʹ和Rev 5ʹ-Gaggtctaggtaggtaggaggtgaag-3ʹ。对GAPDH进行了归一化的相对定量，并使用ΔΔCT方法进行了计算。
通过多个t检验分析，使用GraphPaDprism 7软件（GraphPad软件）进行统计分析。
根据制造商的铬单细胞5'基因表达v.2（10x基因组学）的制造商方案，将富含MAC的富含MAC和总细胞分数加载到基于液滴的SCRNA-SEQ，以每反应获得8,000–10,000个细胞。图书馆的准备是根据制造商的协议进行的。在Illumina Novaseq 6000 S2流动池的两个车道上，对16个库的池进行了测序，并具有50 bp配对的读数。
使用铬单细胞3'基因表达v.2（10x基因组学）制备肠癌，每个反应获得8,000个细胞。在50 bp配对的读数上，将肠道类器官cDNA文库测序。
从制造商协议中详细介绍的5'10x基因组互补DNA（cDNA）库中生成了10x基因组学V（D）J库。将B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）文库（TCR）库合并，并在150 bp配对的读取150 bp的Illumina Hiseq 4000的单个车道上进行测序。
用NEBNEXT单细胞/低输入RNA库准备套件（E6420L；新英格兰Biolabs）进行基于板的SCRNA-SEQ。来自供体分解的肠道切片的总细胞分数BRC2033-2034，F67，F72，F78在10％（v/v）DMSO中以90％（v/v）BSA中的10％（v/v）dmso中的frozen。在37°C的水浴中快速解冻细胞，并用预热的FACS缓冲液缓慢稀释（D-PBS中的2％（v/v）FBS）。通过在300克离心5分钟将细胞颗粒，用300 µL的D-PBS洗涤，并像以前一样沉淀。将细胞重悬于100μL的僵尸水上固定活力试剂盒中（1：200稀释； 423101），并在室温下孵育15分钟。用2 mL FACS缓冲液洗涤细胞，然后用300μl的FACS缓冲液洗涤，并重悬于总计100μl的100μl亮紫650小鼠抗人CD45（稀释1：200; Biolegend，304043），Alexa fluor 700小鼠CD4（ALEXA CD4）抗性1：200; Biole-hum-hum-hum-hum-human and 3005555526;CD19（稀释1：200; BD Biosciences，560727），在室温下在黑暗中孵育20分钟。用300 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次。通过荧光激活的细胞分选（FACS）将单个，活的CD45+细胞分选为384孔板（0030128508; eppendorf）的井中，其中含有2 µL的1×NEB NEB下一个细胞裂解缓冲液（New England Biolabs）。FACS排序是使用BD涌入分散器（BD Biosciences）进行的，并启用了索引设置。将板密封并在100克旋转1分钟，然后立即冷冻在干冰上，并在-80°C下储存。cDNA和测序库的生成是在Bravo ngs工作站（Agilent Technologies）上以自动化方式进行的4。将纯化的池在安捷伦生物分析仪（安捷伦技术）上进行了定量，并在Illumina Hiseq 4000的一个车道上进行了测序。原始读取与使用Star Aligner（v.2.5.1b）的人类转录组V.GRCH38-3.0.0对齐。
使用CellRanger软件v.3.0.0 – V.3.0.2和10倍人类转录组GRCH38-3.0.0作为参考，使用CellRanger软件v.3.0.0.0 – V.3.0.2处理10x基因组学SCRNA-SEQ基因表达原始测序数据。使用CellRanger VDJ V.3.1.0和带有默认设置的CellRanger VDJ V.3.1.0和参考CellRanger-VDJ-Grch38-Alts-3.1.0处理10x基因组学V（d）J IG和轻链。
Pandas（V.1.1.2），Numpy（V.0.25.2），Anndata（V.0.6.19），Scanpy（V.1.4）和Python（v.3）用于汇总单细胞计数和下游分析。分别处理胎儿和成人样品的单细胞转录计数，以控制细胞表达和样品质量的预期差异。对于每次运行，我们将使用默认参数的Soupx算法和函数AdjustCounts（）应用于计数矩阵中删除环境mRNA。将每个数据集的细胞用于500多个基因，小于50％的线粒体读数，并过滤基因在3个以上的细胞中进行表达。应用了0.25的scublet（v.0.2.1）得分临界值，以协助Doublet排除。基于诸如CD3D（TCR的组件）和EPCAM等规范标记的意外共表达，在整个下游处理过程中进行了其他双重排除。将每个细胞的基因表达归一化并对数转换。使用参考文献中列出的97个细胞周期基因的表达来计算细胞周期评分。51。然后去除细胞周期基因以进行初始聚类。细胞周期评分，线粒体读数的百分比和唯一的分子标识符（UMI）在缩放数据之前会退缩。
用BBKNN对胎儿和成人数据集进行批化校正（v.1.3.9，邻居= 2-3，metric ='euclidean'，n_pcs = 30-50，batch_key ='donor_id'或'donor_id'或'batch'）。降低维度降低和莱顿聚类（分辨率为0.3-1.5），并根据每个群集的算法定义的标记基因表达来注释细胞谱系（sc.tl.rank_genes_groups，方法='wilcoxon'）。然后将细胞谱系取代，并重复批处理校正，并重复莱顿聚类以注释细胞类型和状态。然后合并带注释的胎儿和成人数据集，并调整注释以进行一致性。下面提供了每个谱系的细胞类型注释的简要说明。
(EPCAM-positive) shared between fetal, paediatric and adult datasets were stem cells (LGR5, ASCL2, SMOC2, RGMB, OLFM4), Paneth (DEFA5, DEFA6, REG3A), transit-amplifying (TA; MKI67, TOP2A, PCNA), goblet cells (CLCA1, SPDEF, FCGBP, ZG16, MUC2),BEST4肠细胞（BEST4，OTOP2，CA7），肠细胞（RBP2，ANPEP，FABP2）和结肠细胞（CA2，SLC26A2，FABP1），肠内分泌细胞（CHGA，CHGB，NEUROD1），MICROFOLD细胞（SPIB，CCL20，ccl20，lrm as as as as as ass lrm ass ass as ccl20，lrm as as as a as pof and as pof and。IRAG2），TRPM5），在成年结肠样品中观察到最好的2个杯状细胞（扩展数据图5）。在富含最佳2杯细胞的基因中，Kallikreins KLK15和KLK3以及蛋白酶抑制剂WFDC2和WFDC3。在胎儿上皮细胞中，有43个大肠杯状细胞表达了最好的2。胎儿表达2个表达胎儿的细胞与小肠道杯细胞聚集在一起，这可能是由于数据中存在的这些细胞数量少。Enteroendocrine cells were further sub-clustered and annotated based on key hormones expressed (M/X cells (MLN/GHRL), D cells (SST), β cells (INS, possibly from developing pancreatic bud), L cells (GCG), N cells (NTS), K cells (GIP), I cells (CCK) and enterochromaffin cells (TPH1) either expressing neuropeptide W（NPW）或TAC1）。
胎儿特异性子集包括参考文献中所述的近端祖细胞（FGG，BEX5）。基于DLK1，PDX1，RBPJ，CPA1和SOX953的表达，可能是胰腺祖细胞的1,2,3,52，富含结肠基因（CKB，AKAP7，GPC3）和CLDN10细胞的远端祖细胞。该人群也高度表达的CLU，这是先前已经描述的肠道复兴干细胞的标记。54。
（PECAM1，CDH5）细分为动脉（GJA4，HEY1，HEY2，EFNB2），静脉（ACKR1，VWF）和淋巴内皮（Prox1，Lyve1，CCL21）。来自胎儿和成年供体的动脉和静脉细胞形成了单独的簇，基因表达不同，可能反映了胎儿细胞的不成熟。年龄共享的动脉基因中有GJA5，SEMA3G，HEY1，HEY2和年龄共享的静脉基因为ACKR1，ADGRG6，CPE，APLNR。根据RGCC和VWA1的表达来定义毛细管簇。动脉毛细血管专门表达CA4和FCN3。
Lymphatic endothelium further separated into six clusters, including LEC1 (ACKR4, OTC), resembling cells lining the subcapsular sinus ceiling in the human lymph nodes;31 LEC2 (GP1BA, UBD, ANO9, FIBIN, PAPLN) and only LEC expressing MADCAM1 and reassembled LECs lining subcapsular sinus floor in human lymphNodes31。我们进一步定义了主要存在于儿科和成年肠道区域中的LEC3（ADGRG3HI），以及针对开发肠道的特异性数据（图7C）的LEC4（SATB2HI，PTX3HI，CXADRHI）（SATB2HI，PTX3HI，CXADRHI）（图7C），这些数据可能分别代表差异化和不成熟的淋巴管。LEC5（cldn11，degs2，sbspon，angpt2hi，gja4hi）在淋巴结中重新组装收集淋巴瓣膜31。
根据小鼠胚胎55的观测来定义。基于ETV1或BNC2的表达，神经元分支分别命名为A或B分支。分支的亚群命名为A1 -A4和B1 -B3，并在图3A，b中提供了组合基因标记。基于GAL，NOS1和VIP的表达，分支A1在功能上命名为抑制性运动神经元（IMN）。基于NTNG1和NXPH2的分支A2是混合的IPAN/种群。分支A3是IPAN的第二子集/基于NeuroD6表达式22的IPAN/等效于成人PIN3和PSN3; 22; 22分支A4作为中间神经元（in）。基于NXPH4和NDUFA4L2; 22 Branch B2的分支B1作为未成熟的兴奋性运动神经元（EMN）是基于BNC2和PENK的表达； 22,55 Branch B3（IPAN）的第二组EMN集群，分配了基于DLX3，ANO2，ANO2，ANO2，NOG，NOG和NTRK3。分支B3还显示了人类IPAN A种群中描述的CalB2和SST的表达23。
所有末端神经胶质细胞均表达高水平的ENCC祖细胞/末端神经胶质标记基因，包括FOXD3，MPZ，CDH19，PLP1，SOX10，S100B和ERBB3，但缺乏RET。观察到了三种类型的肠神经胶质（S100B，Cryab，MPZ）：Glia 1（DHH，RXRG，NTRK2，MBP），GLIA 2（ELN，TFAP2A，SOX8，SOX8，BMP8B），Glia 3，Glia 3（Bcan，apoe，apoe，calca，calca，calca，hes5，frzb）和12 – colia at a colia at AT220A（colia at 220a）（图3b）。区分神经胶质（COL20A1）簇注释是基于胶质标记的表达，位于区分子集和Scvelo结果之间。
包括先前描述的中胚层中胚层1（Hand1，Hand2，pitx2）和中胚层2（Zeb2）； 1 stromal 1（ADAMDEC1）子集高度表达ADAM28或CCL11，CCL8，CCL8，CCL13；富含F3，NPY或CH25H，MMP1表达的Stromal 2（PDGFRA，BMP4）；基质3（C7）表达kcnn3，lrrc3b或c3，clec3b，sema3e。我们还观察到胎儿gut3中最新描述的基质4人群（MMP1，MMP3，PDPN，COL7A1，CHI3L1）。此外，我们观察到与淋巴结免疫 - 组织成纤维细胞一致的人群，包括T网状细胞（CCL19，Grem1Hi，TNFSF13B）32，卵泡树突状细胞（CXCL13，CR1，CR1，CR2）32，FMO2纤维细胞（CXCL13，CR1，CR1，CR1，CR1，CR1，CR1）根据FOXO1，KLF15，ZBTB16，LMO3，HSD11B156,57的表达，可能代表脂肪基质细胞群的样品。基于肌动蛋白（ACTA2）和经凝胶蛋白（TAGLN），成纤维细胞特征Decorin（DCN）的表达鉴定了肌纤维细胞，但缺乏平滑肌标记肌肉脱粒（DES）。肌纤维细胞种群在HHIP，NPNT，SYT10或RSPO2，SYT1，PTGER1的表达上进一步不同。根据DES，CALPONIN（CNN1）58和肌动蛋白/肌球蛋白链表达（ACTA2，MYH11）的高表达，对平滑肌细胞进行注释，并在参考文献中注释后进一步表征子集。3。基于试剂盒，ANO1和ETV132,59的表达，鉴定出Cajal（ICC）的间质细胞。其他ICC基因包括DLK1，CDH8，CDH10和PRKCQ。根据MKI67，TOP2A，CDK1和其他细胞周期基因的表达来定义循环基质细胞。胎儿MLTO细胞的定义如文本中所述。另外，对于UBD，CLSTN3，SLC22A3，TNFSF11和APLNR表达，MLTO细胞很高。
基于Notch3，MCAM（CD146）和RGS5的表达确定周细胞。基于PDGFRB，CSPG4（编码NG2）58的高表达对未成熟的周细胞进行注释，并以高NDUFA4L2表达为标志。我们进一步注释收缩的周细胞（ACTA2HI），这些收缩性周细胞（ACTA2HI）以PLN，REGRL，KCNA5，KCNAB1，NRIP2的表达为特征。如参考文献中所述，基于Prrx1和Procr的高表达（也在基质细胞中表达），对血管生成周细胞进行了注释。3，更具体地以ENPEP，ABCC8，COL25A1和TEX41为标记。我们还观察到以CD3660（称为“ Pericyte”）为标志的周细胞群体。
在这些细胞中TNNT1，RASSF7和KLK11的表达中，基于KRT19，LRRN4和UPK3B表达定义了间皮细胞在这些细胞中的表达。在成年组织中捕获的成熟周细胞高度表达PRG4，MT1F，MT1G，CP4BPA和HAS1。此外，我们观察到表达RGS5，TMEM235和Serpine3的间皮细胞群。
被定义为具有MS4A1（编码CD20）和CD19的阳性表达的簇。在胎儿B细胞中，根据谱系标记的最小表达和CD34，Spink2和FLT3的特定表达，对常见的淋巴样祖细胞（CLP）细胞进行了分类。pro-B细胞具有DNTT（TDT），重组激活基因（RAG）1和2的特异性表达，B淋巴细胞抗原受体CD79B，V-SET PRE-B细胞替代光链（VPREB1，VPREB1）的高表达和免疫光蛋白链蛋白链链链（VPREB1，VPREB3）和免疫光蛋白 - lamblobulin-lambda链的表达。前B细胞专门表达CD38，并且CD19的表达高于Pro-B细胞。Immature B cells had the highest expression of MS4A1 among B lineage cells and expression of immunoglobulin heavy chains M and D. Adult B lineage cells had distinct clusters of naive B cells (Fc fragment of IgM receptor- FCMR), memory B cells (SELL (encodes CD62L)) and a population of memory B cells that specifically expressed transmembrane immunoregulatory molecule FCRL4 (encodes蛋白质也称为FCRH4），该蛋白被认为是组织限制的62类开关IgA和IgG浆细胞，分别显示了Syndecan，SDC1和免疫球蛋白重链A和G的表达。循环B细胞的特征是通过MKI67（编码KI67）的特异性表达和参与DNA复制的基因，HMGB2，TUBA1B和UBE2C。
如前所述，被确定为带有T细胞受体成分CD3D和亚群的胎儿，小儿和成年细胞的簇，如前所述4。CD4 T细胞具有CD4的表达，但不具有CD8A，反之亦然CD8 T细胞。对于这些T细胞组中的每一个，分配了小儿/成人销售（编码CD62L）幼稚/中央记忆细胞和CD69活化细胞。“活化的T”是由配对V（d）J测序确定的具有生产性TCRαβ链的胎儿细胞。此外，在产后CD4 T细胞中，CXCR3，IFNG TH1和Rorahi，IL22，CD20 TH17细胞。标记为Th1和Th17的小儿CD CD4 T细胞显示了IL22和IL26的额外共表达，与以前报道的这些分子在溃疡性结肠炎中功能障碍CD8 T细胞中的表达相匹配。T调节细胞由FOXP3，CTLA4，TIGIT表达和T表达CXCR5和PDCD1的T卵泡辅助细胞定义。观察到了两个CD8 T记忆细胞的子集：CD8 TMEM和CX3CR1表达CD8 TMEM细胞，它们均表达FGFBP2，S1PR5，FCGR3A和TGFBR3。
成年GDT亚集差异表达的伽玛和三角洲可变链基因。小儿GDT（TRDC）细胞没有TCR测序数据，也没有表达特定的可变链（扩展数据图2A）。TRGV2，TGVG4和TRVG5/TRVG7的特定表达分别编码了伽马TCR链的可变链，分别进一步定义了亚群。我们还观察到胎儿肠道中的TRDV2/TRGV9 GDT细胞的群体。NK T细胞表达CD3D以及NK基因GZMA，NKG7和PRF1。MAIT细胞表达TRAV1，TRAV2和SLC4A10。ILC2表达PTGDR2，HPGD，IL1RL1和KRT164，并在胎儿样品中发现。
根据EOMES，PRF1，NKG7和KIR受体表达定义NK细胞。根据Rorc，IL1R1，IL23R，KIT64和进一步表达TNFS4和PCDH9的表达来定义成年ILC3。如Liver65中所述，ILCP的定义为Lin -IL7R（编码CD127），试剂盒（CD117），RORC（RORγ）细胞，这些细胞进一步表达CCR6，NRP1，而不是NCR2（编码NKP44），如Liver65中所述。ILCP还高表达的趋化因子受体CXCR5和CCR7，由SCN1B66编码的细胞粘附分子以及由HPN编码的丝氨酸蛋白酶。
LTI样NCR+ ILC3细胞的TNFRSF11A（等级）及其配体TNFSF11（RANKL）以及NCR1（NKP46）和NCR2（NKP44）的表达最高NK相关基因在内，包括NKG7，PRF1和GZMA，与MITE中描述的NCR-ILC3细胞一致。与胎儿NRC2+ ILC3相比，我们观察到IL22在成年人中的表达，这表明胎儿肠道ILC3代表未成熟的ILC3对应物。令人放心的是，从胎儿回肠的全长SCRNA-SEQ数据中可以识别出LTI样的亚型（扩展数据图11）。
进一步的亚簇簇为经典的单核细胞（FCN1，S100A4，S100A6），树突状细胞，巨噬细胞，肥大细胞（GATA2，CPA3，HPGDS）和巨核细胞（GP9，LCN2）。在树突状细胞（DCS）中，我们观察到CDC1（CLEC9A）和CDC2（CLEC10A），淋巴样DC（LAMP3）和浆细胞类动物DC（PDCS; Clec4c，Jchain）。在巨噬细胞种群中，我们观察了一部分经典巨噬细胞（CD163，C1QB，C1QC），Lyve1+巨噬细胞（RNASE1，SPP1）先前在心脏血管68和Lung69和lung69和炎症性巨噬细胞（MMP9）中都观察到的； 10我们还可以观察到fetal-sproph sprotil-sproph sprotir-noriil soptir soctir soptal-sodir soptial soptial soperrotr soction-nori nor forno noce reno.（MPO，Azu1，Elane）先前在人胎儿肝30和CLC肥大细胞中描述的，这些细胞可能代表未成熟的胎儿态。
For MHCII scoring of B cells we use the following genes: SECTM1, CD320, CD3EAP (also known as POLR1G) CD177, CD74, CIITA, RELB, TAP2, HLA-DRA, HLA-DRB5, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DQB1-AS1, HLA-DQA2,HLA-DQB2，HLA-DOB，HLA-DMB，HLA-DMA，HLA-DOA，HLA-DPA1，HLA-DPB1。使用参考文献的策划基因集计算神经胶质或神经元细胞的特征评分。70 (glia: ERBB3, PLP1, COL18A1, SOX10, GAS7, FABP7, NID1, QKI, SPARC, MEST, WWTR1, GPM6B, RASA3, FLRT1, ITPRIPL1, ITGA4, POSTN, PDPN, NRCAM, TSPAN18, RGCC, LAMA4, PTPRZ1, HMGA2,TGFB2，ITGA6，SOX5，MTAP，HEYL，GPR17，TTYH1;NF-KB信号通路评分是使用http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp（nfkb2，birc3，birc3，tnfaip2，tnfaip2，tnip1，tnip1，tnip1，notch2，notch2，notch2，tmem173（也已知）cumc cumc cumc culk prd，IKBKB，IKBKE，NFKB1，NFKB2，NFKBIA，NFKBIB，NFKBIE，REL，REL，RELA，RELB）。使用具有默认参数的sc.tl.score_genes（）函数进行评分，以计算以参考基因的平均表达式缩减所选基因的平均表达。
使用PANDA（V.1.1.2）和Numpy（V.0.25.2）包装将来自三个器官生长条件的单细胞计数矩阵合并在一起。分析中包括少于8,000个基因且线粒体读数少于20％的细胞。在少于3个细胞中表达的基因也被排除在外。对于PLCG2表达比较，我们使用归一化（sc.pp.normalize_per_cell）和log-transformed（sc.pp.log1p）计数。使用Seaborn软件包杆图和群函数（V.0.11.0）绘制数据。
在“ n_counts”，“ persion_mito”和“ g2m_score”回归之前，排除了超过6,000个基因和大于25％线粒体读数的细胞。将PTPRC表达的阳性细胞（logTPM+1> = 0.2）前进进行下游分析。如先前所述，使用Tracer软件（https://hub.docker.com/r/teichlab/tracer/）重建了使用SMART-SEQ2 SCRNA-SEQ协议生成的T细胞受体序列。
为了识别特定区域的亚群，我们使用了对K-Nearest邻居（KNN）图形邻居（v.0.99.8）https://github.com.com.com.com.com/marioniliilab/milorrorab/milorrorrorab/milorrorrorror bect offients neighbenork（KNN）Graph社区进行差异丰度测试的工具，对小肠和大肠组织的最佳4个肠细胞进行了组成分析。
简而言之，我们在最佳4个肠细胞上进行了PCA维度降低和嵌入KNN图。我们将邻域定义为通过KNN图中的边缘连接到采样单元的一组细胞。使用算法提出的先前提出的算法对细胞进行采样以进行邻域构造72。然后，对于每个社区，我们在条件之间进行假设检验，以识别差异丰富的细胞状态，同时控制整个图形邻域的FDR。
我们测试成人样品和胎儿样品中大肠组织和大肠组织的细胞之间的丰度差异。为了鉴定小能特异性和大能特异性亚群的标志物，我们在富含小肠细胞的邻域和富含大型肠细胞的邻里的成年细胞之间进行了差异基因表达（DGE）分析（对大肠细胞的富含FDR 10％用于不同的丰度测试）。使用在LIMMA73（v.3.46.0）中实现的线性模型，使用10％的FDR进行了DGE测试，并通过样品汇总表达式（在MILOR软件包的函数findnhoodgroupmarkers中实现，带有选项gentRegateMarkers = true）。基因本体学富集分析是使用R套件簇式Profiler（v.3.18.1）进行的。
对于神经细胞轨迹分析，我们使用SCVELO 0.21包装实现1.5.174。将数据亚簇属于胎儿神经细胞，并使用函数进行预处理，以检测最少数量的计数，使用SCV.PP.FILTER_AND_NOMALALIZE，然后进行SCV.PP.PP.Moments函数。使用scv.tl.velocity（mode ='stochastic'）和scv.tl.velocity_graph（）获得基因特异性速度，通过拟合未贴合和剪接的mRNA丰度之间的比率。使用scv.pl.velocity_graph（）或scv.pl.velocity_embedding_grid（）函数可视化基因特异性速度。为了可视化沿假期变化的基因，我们将sc.pl.paga_path（）函数与设置为monocle3 pseudotime的伪频率。此功能需要计算PAGA参数和DPT_PSEUDOTIME，其功能如下：sc.tl.paga（），sc.pl.paga（），sc.tl.draw_graph（init_pos ='paga’），sc.tl.dpt（sc.tl.dpt（）75。
如前所述进行单细胞BCR分析76。简而言之，丢弃了质量差或不完整的V（d）J重叠序列，并将每个供体的所有IGH序列合并在一起。在使用digtegenge.py（presto78）的同型重新分配之前，用Igblast77注释IGH序列。使用Tigger V.03.179校正模棱两可的V基因调用，然后使用decteclones.py（更改v.0.4.4.579）使用0.2的阈值识别克隆相关的序列。使用CreateGermlines.py（更改V.0.4.5）确定每个克隆家族的生殖线IGH序列，然后使用观察到的（Shazam v.0.1.1179）来计算单个序列的体细胞超变态频率。最后，对于与单细胞基因表达对象的整合，确定每个细胞条形码的每个IG链（IG，IGK，IGL）的高质量和注释重叠群的数量。如果检测到给定链的多个唯一序列，则将细胞注释为“多”，而在进一步分析中不考虑。将BCR元数据与SCRNA对象结合使用，用于下游分析和对不同B细胞群体的比较。
为了推断涉及的配体和受体的细胞 - 细胞通信和筛查，我们将CellphonedB v.2.0 Python package 80,81应用于归一化的原始计数和妊娠中期肠中样品的细胞型注释（12-17 PCW）。我们使用默认参数并将子集设置为5,000个单元格。为了确定最相关的相互作用，我们根据群集内超过10％的细胞中的配体/受体表达来将特定的相互作用子集取决于特定的相互作用，并且对log2的平均表达表示大于0。将所选的相互作用绘制为相关细胞类型中配体和受体的表达。
与HSCR相关的基因是从人类表型本体网站（https://hpo.jax.org/app/，Aganglionic Megacolon HP：0002251）和参考文献中策划的。25。我们在神经谱系单细胞中选择了表达大于或等于0.1的基因，并计算了每个簇和器官的平均表达。使用seaborn.clustermap（）函数（v.0.11.0）可视化表达。
每个样品的细胞数量（n = 159个样品总共具有完整元数据）和粗粒细胞类型（总共9种不同的细胞类型）组合使用带有泊松结果的广义线性混合模型进行建模。将五个临床因素（年龄组，捐助者，活检，疾病和性别）和三个技术因素（分数，酶和10倍试剂盒）拟合为随机效应，以克服这些因素之间的共线性。通过与细胞类型的相互作用项来估计每个临床或技术因素对细胞类型组成的影响。在R上实现的LME4软件包中的“ GLMER”功能用于适合该模型。使用NumDeriv软件包估算了每个因素的标准偏差参数的标准误差。通过相应的随机效应系数的后平均值获得了每个临床或技术因素的效应大小，并根据后验分布计算局部真实符号率（LTSR）。有关更多详细信息，请参见补充注释第1节。
炎症性肠道疾病全基因组关联研究（IBD GWAS）的摘要统计数据是克罗恩病和溃疡性结肠炎，是从国际炎症性肠病遗传联盟（IIBDGC）（https://wwww.ibdgenetics.org/）中获得的。使用FGWAS方法82,83对103个注释的肠道细胞类型和溃疡性结肠炎进行了GWAS富集分析，通常用于分子定量定量性状和GWAS基因座的各种功能注释的精细映射和富集分析。使用Wakefield Affer84将关联统计数据（对数比值比和标准误差）转换为近似贝叶斯因子。为每个基因定义了一个以转录起始位点（TSS）为中心的1 MB的顺式调节区域（Ensembl Grch37版本101）。根据调节相互作用的距离分布估算的先前概率（TSS接近度的指数函数）对每个顺式区域中存在的变体的贝叶斯因子进行了加权和平均。85。FGWAS模型的可能性是由所有全基因组基因的平均贝叶斯因子给出的，乘以从细胞型特异性表达的线性组合获得的特征级别的先验概率和所有细胞类型的平均表达作为基线表达。每种细胞类型的富集估计为细胞类型特异性表达效应大小的最大似然估计量。层次模型的代码（https://github.com/natsuhiko/phm）用于富集分析。补充注释第2节中证明了详细的模型推导。
10倍基因组学方案应用于最佳切割温度培养基（OCT）填充的新鲜冷冻样品。使用Leica CX3050S低温恒温器对所有组织进行切片，并以10 µm的形式切割。根据使用Agilent2100生物分析仪获得的形态，方向（基于H＆E）和RNA完整性数选择样品。进行了组织优化，以获得胎儿组织（12分钟）的透化时间，并在优化后使用10倍基因组学的空间基因表达方案使用库制备幻灯片并遵循制造商的方案进行。转录本捕获后，执行了10倍基因组学的覆盖库制备方案。此过程的所有图像均以Hamamatsu Nanozoomer S60的40×扫描。将八个cDNA文库稀释并汇总至最终浓度为2.25 nm（200 µl体积），并在Illumina Novaseq 6000的2×SP流动细胞上进行测序。
使用10x基因组基因组间隔剂v.1.2.1将10倍基因组的空间测序样品对齐与人转录组GRCH38-3.0.0参考（与单细胞RNA-SEQ样品始终如一），并使用外部读数来生成每个样品的mRNA计数。10倍基因组间隔也可用于将成对的组织学图像与mRNA捕获斑点幻灯片的位置对齐。配对图像用于确定组织中每个森林位置的平均核数，并用作细胞类型的空间映射中的高参数。
为了在空间绘制原位开发肠道细胞类型的空间图中，使用细胞2-置置法与SCRNA-SEQ数据集成了10倍基因组学visiumics MRNA计数矩阵，如前所述34。简而言之，通过使用参考细胞类型的转录特征将10倍基因组学森林数据中的mRNA计数分解在10倍基因组学数据中，通过分解每个位置的每个细胞种群的丰度。将65个细胞群（神经元和间充质亚型的参考特征分组在一起，以简化对空间映射的解释），从12-17 PCW小肠样品中使用负二项式回归模型估算了12-17 PCW小肠样品。我们提供了GitHub上所有65个细胞集的空间细胞丰度图（https://github.com/vitkl/fetal_gut_mapping/），以及扩展数据中所有65个细胞集的分布图9a – c。
未转换和不均衡的mRNA计数被用作回归模型的输入，以估算签名（过滤为13,904个基因和124,049个细胞）和Cell2-location模型，用于估计细胞群的空间丰度（过滤至SCRNA-SECOLED CONISSED，与SCRNA-SEEQ共享13,904个基因，4,4,645个位置，3个实验），3实验，3实验。
使用以下设置（所有其他设置为默认值）使用Cell2Location：训练迭代：40,000；每个位置的细胞，基于与11倍基因组学覆盖的组织学图像进行比较估计；假设给定位置中的大多数单元都有不同的类型，则每个位置的细胞类型。每个位置共置的细胞类型组。
为了鉴定属于它们的组织区域和细胞类型组（扩展数据图15C，DOT图），将常规的非阴性基质分解（NMF）应用于通过细胞2LACATION估算的细胞丰度。对NMF模型进行了一系列因素和组织区R = {8，…，35}的培训，并将分解为17个因素被选为将相关组织区（淋巴结结构，血管类型）和过度分离的已知区域分割成几个不同因素之间的平衡。每个因子的NMF重量和细胞类型的重量在扩展数据中显示。图15C。
将胎儿肠道组织嵌入OCT中，并在-60°C下冷冻在等异教级冰浆中，然后冷冻到Superfrost加上厚度为10μm的幻灯片上。在染色之前，将组织切片在4％的PBS中的4％多聚甲醛中固定15分钟，然后通过一系列50％，70％，100％和100％乙醇脱水，每个乙醇5分钟。根据制造商的指示，使用雷卡键RX染色（高级细胞诊断，生物 - 卫生机）用Leica Bond RX自动化染色。在手动预处理后，自动化处理包括蛋白酶消化的表位IV检索30分钟，然后再进行rnascope探针杂交和通道开发，并使用Opal 520，Opal 570和Opal 650染料（Akoya Biosciences）。使用20倍的水免疫物镜（Na 0.16，0.299μm），用Perkin Elmer Opera phinix高意见筛选系统成像，以1μmz-step尺寸的共聚焦模式成像。频道：DAPI（激发375 nm，发射435–480 nm），Opal 520（Ex。488nm，Em。500–550 nm），Opal 570（Ex。561nm，Em。570–570–630 nm），Opal 650，Opal 650（例如640 NM，Em。650-7650nm）。第四通道是使用TSA-生物素（TSA Plus Biotin Kit，Perkin Elmer）和链霉亲和素偶联的Atto 425（Sigma-Aldrich）开发的。
C57BL/6小鼠接受了正常的饮用水或2％（w/v）36,000–50,000 MW葡萄糖硫酸钠（DSS）（MP BioMedicals）诱导结肠炎。对于DSS治疗，小鼠接受了DSS水5天，然后接受14天的正常饮用水，然后在被淘汰之前的最后5天为2％（w/v）DSS。
小鼠的小肠被用冰冷的PBs冲洗粪便，纵向打开，切成0.5厘米的碎片，并用带有10 mm HEPES的PBS涡流洗涤3次。然后将组织与上皮剥离溶液（RPMI-1640，2％（V/V）FC，10 mM HEPES，1 mM DTT和5 mM EDTA）在37°C下进行20分钟，以消除上皮细胞。随后将上皮馏分在37°C下与配置（0.3 U ml-1，Sigma-Aldrich）一起孵育10分钟，并通过100 µm滤光片以获得单细胞悬浮液。将细胞在4°C下用0.5％（v/v）热灭活的小鼠血清封闭20分钟，然后在4°C下在PBS中染色45分钟，使用以下抗体。EPCAM-FITC（1：400，G8.8，Invitrogen），CD45-BV650（1：200，30-F11，Biolegend），CD11B-BV421（1：300，M1/70，M1/70，BD BIOSCIENCES），SIGLEC-F-APC（1：1：200，1RNM444N，Invitrogen，fc 2（1：200，1rnm44n，fc 2）X54-5/7.1, BioLegend), FcγRIIB-PE (1:200, AT130-2, Invitrogen), FcγRII/RIII-PE-Cy7 (1:200, 2.4G2, BD Biosciences), FcγRIV-PE (1:200, 9E9, BioLegend) and Rat IgG2b, κ isotype-PE-Cy7 (1:200,Lou/C，BD Biosciences）。然后，用活/死固定的水上死细胞染色套件（Thermo Fisher Scientific）在室温下染色20分钟，用2％PFA固定，并在Cytoflex LX（Beckman Coulter）流式细胞仪上进行分析。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。