如前所述2,5，我们从臀部细胞中产生了HCO。为了从喂食器上培养的髋关节细胞产生HCO的产生，使用配置（0.35 mg ml-1）从板上提起完整的臀部细胞菌落，并在辅助两种smad抑制剂的hips细胞培养基中转移到超低附着塑料培养皿（康宁）中（10μM; 1614，Tocris）和岩石抑制剂Y-27632（10μM； S1049，Selleckchem）。在最初的5天中，每天更改臀部细胞培养基，并补充背酚和SB-431542。On the sixth day in suspension, neural spheroids were transferred to neural medium containing neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement without vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin and streptomycin (1:100, Life Technologies) and supplemented with the epidermal growth factor (EGF;20 ng ml-1; R＆D系统）和成纤维细胞生长因子2（FGF2; 20 ng ML-1; R＆D系统）直到第24天。从第25天到第42天，培养基均以脑源性神经营养因子补充每隔一天的中等变化。从第43天开始，将HCO维持在不受补充的Neurobasal-A培养基（NM； 1088022，Thermo Fisher）中，每4-6天都会发生培养基变化。为了从无馈物条件上培养的髋关节细胞产生HCO，将臀部细胞与Accutase（AT-104，创新的细胞技术）在37°C下孵育7分钟，孵育7分钟，将单个细胞分离为单个细胞，并在34815，STEMCELL技术中播种到aggrewell 800板中，将其与33个单个细胞的密度分别为8培养基。（10μm; S1049，Selleckchem）。24小时后，通过将井中的移动介质上下移动并将其转移到超低附件塑料菜肴（3262，康宁）中，从每个微孔收集球体。 含有补充后型（2.5μm; p5499，Sigma-Aldrich）和SB-431542（10μM; 1614，Tocris）的必需6培养基（A1516401，生命技术）。从第2天到第6天，必需的6个培养基每天都会更改，并补充了背酚和SB-431542。从悬浮液的第六天开始，将神经球体转移到神经质培养基中，并如上所述保持。
所有动物程序遵循斯坦福大学实验室动物护理行政小组批准的动物护理指南（APLAC）。购买了孕妇的RNU rnu rnu（RNU/+）大鼠（Charles River Laboratories）或繁殖在房屋中。在12小时的光线周期内维持动物，并随意提供食物和水。三到七日大的无胸腺（FOXN1 - / - ）大鼠幼崽在淘汰前通过未成熟的晶须生长鉴定出来。将幼崽（雄性和女性）用2-3％的异氟烷进行麻醉，并安装在立体定位框架上。在S1上方进行了直径约2-3毫米的颅骨切开术，可保留硬脑膜完整。接下来，使用30克针（约0.3毫米）刺穿硬脑膜，靠近颅骨切开术的侧面。接下来，将HCO移至3×3厘米的薄片上，并去除多余的培养基。使用汉密尔顿注射器连接到23 g，45°针头，将HCO轻轻拉入针的远端尖端。接下来，将注射器安装在连接到立体静脉设备的注射泵上。下一个针头的尖端位于硬脑膜的0.3毫米宽的预制穿刺上方（Z = 0 mm），将注射器降低1-2 mm（Z =左右–1.5 mm），直到形成针头和硬皮植物之间的紧密密封。接下来，将注射器抬高至z = –0.5 mm的皮质表面的中心，并以每分钟1-2 µl的速度弹出HCO。注射HCO后，将针头以每分钟0.2-0.5 mm的速度缩回，闭合皮肤，然后将幼犬立即放在温暖的热垫上，直到完全恢复。一些动物被双侧植入。
所有动物程序遵循斯坦福大学APLAC批准的动物护理指南。将大鼠（移植后60天以上）用5％的异氟烷进行麻醉，用于诱导，成像过程中1-3％的异氟烷。为了进行成像，与国际电力公司（IECO）梯度司机（一个120毫米的内径屏蔽梯度插件（600 mt/m，1,000 t/m/m/s），Avance III Electronics，8-Electivilitions，Mustrivioners Multi-caberrience and Pariefruce and Pariquequequequequequequequequequequequequequequequeque，为成像带来了积极屏蔽的Bruker 7 Tesla水平孔扫描仪（Bruker Corp.）使用6.0.1平台。用86毫米内径积极去偶联体积射频线圈进行采集，并使用四通道冷却的冷冻接收射线频线进行。轴向2D涡轮稀有时间（重复时间= 2,500毫秒，回声时间= 33毫秒，平均2）16切片采集，并用0.6-0.8毫米的切片厚度，256×256个样品进行。接收信号，并具有2厘米内直径的正直传输体积射频线圈（Rapid MR International，LLC）接收信号。最后，使用IMARI（BITPLANE）内置表面估计功能进行3D体积渲染和分析。成功的移植被定义为移植，导致移植半球中T2加权MRI信号的连续区域。失败的移植被定义为移植，不会导致移植半球中T2加权MRI信号的连续区域。皮层T-HCO被排除在随后的分析之外。
为了稳定地表达HCO中的GCAMP6s进行两光子钙成像，臀部细胞被PLV [EXP] -EF1A :: GCAMP6S-WPRE-PURO感染，然后选择抗生素选择。简而言之，在聚甲烯（5 µg mL -1）和15 µL病毒的情况下，在Essential 8培养基中，将细胞与EDTA分离，并在1 mL的1 mL中以约300,000个细胞的密度悬浮。然后将细胞在悬浮液中孵育60分钟，并以每孔50,000个细胞的密度播放。一旦汇合，将细胞用5-10 µg mL -1嘌呤霉素处理5-10天，或直到出现稳定的菌落。如先前所述5所述进行了一些修改，进行了HCO的急性感染。简而言之，将第30-45天的HCO转移到1.5 ml微输出式Eppendorf管中，其中包含100 µL神经培养基。接下来，除去大约90 µL培养基，并将3–6 µL高映射病毒（0.5×108至1.2×109）添加到管中，然后将HCO移至孵化器30分钟。接下来，将90-100 µL培养基添加到每个管中，然后将管返回到孵化器中过夜。第二天，HCO被转移到低跟踪板中的新鲜神经培养基中。7天后，将HCO移至玻璃底24孔板进行成像和感染质量评估。PLV [EXP] -SYN1 :: EYFP-WPRE和PLV [EXP] -SYN1 :: HCHR2-EYFP-WPRE由VectorBuilder生成。慢病毒用于大多数实验，因为它被掺入允许在受感染细胞谱系中的报告基因组中掺入。对于狂犬病的追踪，第30-45天HCO与狂犬病-ΔG-EGFP和AAV-DJ-EF1A-CVS-G-WPRE-PGHPA（质粒＃67528，Addgene）共同感染，在3天的过程中彻底洗涤，并在3天内进行了大鼠S1，并在VIV中进行了维护，并在Vivo中进行了7-14天的维护。
对于免疫细胞化学，对动物进行了麻醉和心铁的灌注，然后用PBS灌注4％多聚甲醛（PBS中的PFA；电子显微镜科学）。将大脑用4％PFA固定2 h或在4°C下过夜，在PBS中的30％蔗糖中冷冻保存48-72 h，嵌入1：1，30％蔗糖中：octe octecoune oct oct oct oct oct oct oct 4583，4583，sakura finetek），sakura finetek），并使用30μm（croce cyrica）（coronally cyrica）（cryce）（cryce）。为了在较厚的部分中进行免疫组织化学，用PBS灌注动物，然后使用纤维状态（Leica）在300–400μm处进行剖析，并在300-400μm上切片，然后用4％PFA固定切片30分钟。然后用PBS洗涤冷冻切片或厚切片，在室温下（10％正常驴血清（NDS）和0.3％Triton X-100稀释）在PBS中堵塞1小时，并在4°C下用封闭溶液中的初级抗体在4°C下孵育。将冷冻切片孵育过夜，而厚的切片孵育5天。使用的主要抗体为：抗neun（鼠标，1：500; AB104224，ABCAM）抗CTIP2（大鼠，1：300; AB18465，ABCAM），抗GFAP（Rabbit，1：1,000; Z0334，Dako），Dako，Dako），Anti-GFP（Chicken，1：1：1：1：1,000; GTX13970，MOUTS;1：200; AB191181，ABCAM），反纽恩（Rabbit，1：500; Abn78，Millipore），抗PDGFRA（Rabbit，1：200; SC-338; SC-338，Santa Cruz），Anti-PPPP1R17（Rabbitab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (goat, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (goat, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio),抗SATB2（小鼠，1：50; AB51502，ABCAM），抗GAD65/67（Rabbit，1：400; Abn904，Millipore）和抗IBA1（山羊，1：100; AB5076，ABCAM）。然后将切片用PBS洗涤，并在室温（冷冻切片）或在4°C（较厚的切片）下与二抗孵育1小时。在1：1的阻断溶液中稀释的Alexa荧光二抗（生命技术），使用了000。用PBS洗涤后，用Hoechst 33258（Life Technologies）可视化核。最后，使用Aquamount（PolySciences）使用盖玻片（Fisher Scientific）安装载玻片，以进行显微镜，并在钥匙荧光（BZ-X分析仪）显微镜或Leica TCS SP8（LAS-X）共焦显微镜上成像。图像是在ImageJ（fiji）中处理的。为了量化T-HCO和大鼠皮层中人类神经元的分数，在T-HCO中心，边缘或相邻大鼠皮层中拍摄了387.5 µm宽的矩形图像。通过评估组织透明度的变化，HNA+核和/或组织自动荧光的存在来确定移植物的边缘。在每个图像中，将Neun+和HNA+细胞的总数除以同一区域内的Neun+细胞的总数。为了确保仅计算成像平面中的核细胞，仅包括Hoechst+的细胞被包括在计算中。将两张图像至少相距至少1毫米，用于减少统计误差。
在采集样本前一周，将用HCO移植的动物（大约8个月的分化）安置在黑暗的房间中，并修剪了晶须以最大程度地减少感觉刺激。如先前所述的31进行了一些修改，进行了核分离。简而言之，使用2-ml玻璃组织研磨机（D8938，Sigma-Aldrich/kimble）使用洗涤剂机械细胞裂解方法来破坏T-HCO和HCO。然后，使用40μm滤光片对粗核进行过滤，并在320g下在4°C下以320g离心10分钟，然后执行蔗糖密度梯度。在离心步骤（在4°C下为320g持续20分钟）后，将样品重悬于0.04％BSA/PBS中，并补充了0.2UμL-1 RNase抑制剂（40UμL-1，AM2682，Ambion），并通过40μmMiFlowMi滤光片。然后将解离的核重悬于含有0.02％BSA的PBS中，并加载到铬单细胞3'芯片上（估计每个通道8,000个细胞估计回收率）。用铬单细胞3'GEM，库和凝胶珠套件V3（10倍基因组学）制备snRNA-seq库。Admera Health在Novaseq S4（Illumina）中汇总了来自不同样品的库。
使用10倍基因组细胞分析软件套件（6.1.2）对每个推定的核条形码定量基因表达水平。具体而言，将读取映射到组合的人（GRCH38，集合发行98）和大鼠（RNOR_6.0，集合版本100）参考基因组，并使用MKREF命令创建并使用–include-introns = true的count命令进行量化，以包含读取映射到内含性区域的读取。对于T-HCO样品，根据保守要求至少95％的总映射读数与人类基因组保持一致，从而鉴定了人核。所有随后的分析均在使用R（版本4.1.2）软件包SEURAT（版本4.1.1）32上从CellRanger输出的过滤条形码矩阵进行。
为了确保仅包括高质量的核用于下游分析，为每个样品实现了一个迭代过滤过程。首先，检测到少于1,000个唯一基因的低质量核，占总数占总计数的20％的20％的线粒体计数被鉴定并去除。随后，使用sctransform函数（vst.flavor =“ v2”），通过正规化的负二项式回归对原始基因计数矩阵进行标准化，该函数还使用默认参数确定了前3,000个高度可变的基因。使用主体成分分析（PCA）在顶部可变基因上的降低降低，并在PCA空间中鉴定了核的簇，并通过共享最近的邻居图构造和Findneighbors和FindneignClusters实现的模块化检测来鉴定，并使用30个数据集= 30（DIMS = 30）（基于dims consection commine comminate andection andection comminate andection comminate andection and findneighbost and findneighbost and findneightility检测）。随后，我们根据较低的低基因计数（低于第10个百分位数的中位数）（中位数），高分位线粒体基因（中位数的中位数（以高于第95个百分位数）的比例识别，/或高分3次识别次数的次数识别，我们进行了迭代的聚类（分辨率= 1），以识别和去除假定的低质量细胞簇并取消较高的高分位基因，并识别额定值次数的次数加倍。高于第95个百分位）。T-HCO样品（n = 3）和HCO样品（n = 3）分别使用IntegatedAta函数与上述参数分别集成。如上所述，随后在集成数据集上进行了另一轮质量过滤。
除去低质量的核后，将集成的数据集聚类（分辨率= 0.5），并嵌入为UMAP34的可视化目的。使用默认参数的Findmarkers函数确定每个群集的标记基因，该功能在归一化基因表达数据上计算出来。我们通过与参考人类胎儿和成人皮质数据集的集成，通过标记19,20,21,35基因表达和注释来确定并分类主要细胞类别。具体而言，通过MKI67和TOP2A的表达来鉴定循环祖细胞。祖细胞簇是通过缺乏有丝分裂转录物的定义，高簇重叠至中期皮层晚期中描述的多能神经胶质祖细胞簇以及EGFR和OLIG1的表达。我们使用“星形胶质细胞分化的多个状态”，从径向胶质细胞到星形胶质细胞的成熟。星形胶质体簇表示高水平的SLC1A3和AQP4，并显示了映射到胎儿radial胶质细胞亚型和/或成年星形胶质细胞上。OPC表示PDGFRA和SOX10，而少突胶质细胞表示髓鞘形成标记（MOG和MYRF）。通过存在神经元转录本（SYT1和SNAP25），不存在GABA能标记（GAD2）和NeuroD6，SLC17A7，BCL11B或SATB2的表达来鉴定谷氨酸能神经元。将GLUN神经元进一步分为上层（SATB2的表达和BCL11b的缺失）和深层（BCL11b的表达）子类。推定的子板（SP）神经元表达已知的SP标记18，例如ST18和SORCS1，除了深层lun标记。脉络丛样细胞是通过TTR和脑膜样细胞表达的表达成纤维细胞相关基因的，并映射到参考数据集的瘦脑/血管细胞的定义。
T-HCO和HCO子类之间的差异基因表达分析是使用近期开发的伪库kAss36在样本重复的跨样品中进行的，并用libra r软件包实现（版本1.0.0）。具体而言，EDGER（版本3.36.0，r软件包）对数可能性比率测试是在分别对每个样品重复的给定细胞类求和的基因计数之间进行的。对于热图可视化，使用EDGER（CPM（）函数）计算出每百万（CPM）归一化表达值的计数并缩放（达到平均值= 0，标准偏差= 1）。Gene ontology (GO) enrichment analyses among significantly upregulated t-hCO GluN genes (Benjamini–Hochberg-adjusted P values less than 0.05, expressed in at least 10% of t-hCO GluN cells, and fold change increase of at least 2) were performed using the ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37.我们使用了带有默认参数的TOPPFUN应用程序，并报告了Benjamini – Hochberg调整后的P值，从GO注释中计算出的超几何测试。
为了将我们的snRNA-seq簇映射到注释的细胞簇中，从参考初级成人单细胞RNA-seq或snRNA-seq研究19,20,21,22，我们进行了成对数据集的整合方法。我们使用SEURAT中的SCTRANSFORM归一化（V2）工作流来集成和比较数据集之间的群集重叠（使用上述相同的参数）。将单个数据集随机子集随机子集，每个原始群集最多有500个单元格或核，以提高计算效率。使用先前描述的类似方法，将群集重叠定义为与参考群集标签重叠的每个集成群集中细胞或核的比例。为了进一步对Glun进行分类，我们利用Seurat中的TransferData工作流程在Glun子集数据上，将参考数据集标签分配给我们的Glun细胞。
为了评估T-HCO和HCO样品的全球转录组成熟态，我们比较了伪库样品与勃雷恩斯潘/Psychencode23，该样品由大量的RNA-Seq涵盖人脑发育。我们从10个概念后的皮质样品中进行了归一化样品的基因表达基质进行了PCA，该基因概念后及以上的年龄较大，该样品以前被鉴定为5,567个基因（与我们的数据共享），这些基因先前被识别为在跨布雷恩斯潘普斯皮质样品中受到发育的调节（定义为使用Cubicic Model）的50％方差（定义为50％的变异）38。如前所述，我们进一步获得了与主要神经发育转录组特征相关的基因，如前所述38。Zhu等人38所述的五个签名中的每个签名中的每一个都在扩展数据中绘制了从非负矩阵分解过程计算出的样品权重。同样，从先前发表的研究中获得了依赖活性的转录标记。具体而言，从Hrvatin等人的补充表3中获得了视觉刺激后，通过SnRNA-Seq收集的SnRNA-Seq收集的SnRNA-Seq收集识别的谷氨酸能神经元的ERG和LRGS显着上调。富含人体的LRG是从用KCL激活的人类胎儿脑培养物获得的，并在刺激后6小时收集，这些基因被过滤的基因在人类中显着上调，但未在啮齿动物中17（补充表4）。使用这些基因集的基因集富集分析是使用单方面的Fisher精确检验进行的。
Rats were anaesthetized with isoflurane and brains were removed and placed in cold (approximately 4 °C) oxygenated (95% O2 and 5% CO2) sucrose slicing solution containing: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 and 0.5 mM CaCl2（大约310 MOSM）。如前所述39，使用Leica VT1200振动组对冠状大鼠脑切片（300–400 µM）进行了切片。然后在室温下将切片移至连续充氧的切片室，其中包含：10 mm葡萄糖，26 mm Nahco3，2.5 mm Kcl，1.25 mm NaHPO4，1 mm mgSO4，1 mm mgSO4，2 mm cacl2和126 mm nacl（298 mosm），至少可录制为45 min 45 min。切片记录是在淹没的腔室中连续灌注ACSF的（用95％O2和5％CO2泡泡）。所有数据均在室温下记录。将T-HCO神经元用硼硅酸盐玻璃移液器填充，其中含有127 mm葡萄糖酸钾，8毫米NaCl，4 mm镁ATP，0.3 mm钠GTP，10 mm HEPES和0.6 mm EGTA和0.6 mm EGTA，pH 7.2，使用KOH（2900090 MOSM）调整。为了重建目的，将生物细胞（0.2％）添加到记录溶液中。
使用多机灯700B放大器（分子设备）和Digidata 1550b数字化器（分子设备）获取数据，在2 kHz处过滤的低通量，以20 kHz数字化，并使用夹具（Molecular Enception）分析，并使用夹具（分子设备），OriginPro 2021b，Originpro 2021b，originlab（Originpro 2021b）和定制Matlab（数学）。使用JPCALC计算液体连接电位，并用估计的-14 mV校正记录。I – V的操作是根据从–250到750 pa的一系列当前步骤构建的。
如前所述25，在丘脑皮层切片中对丘脑，白质和S1传入的电刺激进行了HCO神经元记录。简而言之，大脑位于在10°倾斜的3D打印阶段，额叶的角度为35°。然后将大脑粘在切割表面上，并产生保留丘脑皮层投影轴突的切片。将双极钨电极（0.5MΩ）安装在第二个微型手持剂上，并在策略上定位以刺激每个细胞的四个区域（内部胶囊，白质，S1和HCO）。在0.03–0.1 Hz的300-µA阶段刺激后记录突触反应。
用480 nm的LED生成（Prizmatix）光脉冲激活HCHR2表达HCO的HCO神经元，该脉冲通过×40物镜（0.9 na; Olympus）传递到HCHR2表达过程中。照明场的直径约为0.5毫米，总强度为10-20 mW。将脉冲宽度设置为10 ms，这对应于行为训练实验中传递的脉冲。应用了从1到20 Hz的多个刺激频率，但是为了进行定量，仅使用了火车的第一个脉冲。训练间隔通常长30秒以上，以最小化突触抑郁或促进途径。为了测试HCHR2响应是否是单突触的，我们将TTX（1 µM）应用于浴缸，直到消除EPSC响应为止，然后使用4-氨基 - 吡啶（4-AP; 100 µM）。通常，在几分钟内恢复了响应，LED发作和EPSC生成之间的延迟略长。应用NBQX（10 µM）测试反应是否由AMPA受体驱动。
如前所述，生成急性HCO切片。简而言之，将HCO切片嵌入4％琼脂糖中，并将其转移到含有126 mM NaCl，2.5 mM KCl，1.25 mM NAH2PO4、1 mM MGSO4、2 mM CACL2、2 mm Cacl2、26 mm Nahco3和10 mm NaHCo3和10 mm-（+） - glucose的ACSF中。使用LEICA VT1200振动组在室温下在室温下切片切片，并在室温下保持ACSF。然后在直立的切片显微镜（Scientifica）下进行HCO切片的全细胞贴片夹记录。将切片灌注ACSF（用95％O2和5％CO2泡泡），并在室温下记录来自细胞的信号。将HCO神经元用硼硅酸盐玻璃移液器填充，其中装有含有127 mM葡萄糖酸钾，8 mm NaCl，4 mm镁ATP，0.3 mm钠GTP，10 mm HEPES和0.6 mm EGTA，EGTA，pH 7.2，使用KOH（2900090 MOSM）调节。出于重建目的，将0.2％的生物细胞添加到内部溶液中。
使用夹具（夹具11.1，分子设备）获取数据，该数据使用多键700b的放大器（分子设备）和Digidata 1550b数字仪（分子设备），低量滤波在2 kHz时，使用20 kHz进行了数字化，并使用clampfit（Quandbits）进行了分析（版本9.6B），并进行了分析。功能。使用JPCALC计算液体连接电位，并用估计的-14 MV液体连接电位校正记录。I – V的操作是根据–50至250 pa的一系列当前步骤构建的。
为了形态重建斑块夹神经元，将0.2％的生物细胞（Sigma-Aldrich）添加到内部溶液中。闯入后至少填充细胞15分钟。然后将移液器缓慢地缩回，超过1-2分钟，直到记录的膜完全重新密封。遵循切片生理学的程序，将切片在4％PFA中固定在4°C下过夜，然后用PBS X3洗涤，然后用链霉亲和素偶联蛋白偶联的Dylight 549或Dylight 405或Dylight 405（Vector Labs）在1：1,000稀释的情况下孵育2小时，以在室温下以2％的培养基（2％; s-2％）（2％; s-sig;然后将切片安装在使用Aquamount（Thermo Scientific）上的载玻片上的显微镜上，并第二天在Leica TCS SP8共聚焦显微镜上成像，使用×40 1.3 Na，油浸入物镜，以×0.9-1.0的缩放为×0.9-1.0变焦，XY采样频率约为每微米的XY采样频率约为7个Pixels。串行以1-μm的间隔获得Z堆栈，并进行Z-stack瓷砖和基于Leica的自动缝线以覆盖每个神经元的整个树突树。随后使用NeTube Interface40并生成SWC文件，对神经元进行了半手动跟踪。下一个文件将加载到fiji（ImageJ，版本2.1.0; NIH）插件SimpleNeuriteTracer41。
根据斯坦福大学机构审查委员会批准的协议，通过知情同意获得了人脑皮质组织。从额叶皮层（中额回）切除，作为治疗医学性难治性癫痫的手术的一部分，从额叶皮层（中部额叶中部）切除获得了两个产后人体组织样品（3岁和18岁）。切除后，将组织收集在含有：92 mm NMDG，2.5 mm KCl，1.25 mm NAH2PO4、30 mm Nahco3、20 mm Hepes，25 mm葡萄糖，25 mm葡萄糖，2毫米Thiourea，2 mm thiourea，2 mm Na-abascorbate，3mmmm-na2和0.5mMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM中，10毫米毫米4·7H2O。用浓盐酸将pH滴定为7.3-7.4。在30分钟内将组织转移到实验室，并根据上述程序进行冠状切片。
所有动物程序遵循斯坦福大学APLAC批准的动物护理指南。将大鼠（移植后140天以上）用5％的异氟烷进行麻醉，用于诱导，在手术过程中1-3％的异氟烷。将动物置于立体定位框架（KOPF）中，并皮下施用丁丙诺啡持续释放（SR）。颅骨被暴露，清洁，并插入3-5个骨螺钉。为了靶向T-HCO，我们根据MRI获得的图像生成了立体定向坐标。在感兴趣的部位钻了一个毛刺孔，并将纤维（直径为400μm，0.48 na，多立克）降低至HCO表面以下100 µm，并用UV固定牙齿水泥（Relyx）固定在头骨上。
如前所述42进行纤维光度计记录。为了记录自发活动的记录，将大鼠放入干净的归宿中，并直径为400 µm的纤维 - 光贴片线（Doric）与纤维光度摄取系统耦合到植入的光纤纤维。在10分钟的自发活动记录期间，动物可以自由探索归宿。对于诱发活性的记录，用5％异氟烷和1-3％的异氟烷进行维持，将大鼠（移植后超过140天）的大鼠（超过140天）进行麻醉。将动物放入立体定位框架（KOPF）中，将与T-HCO对侧的晶须修剪成大约2 cm，并穿过网状螺纹，并通过网状螺纹与压电电动执行器（PI）耦合。连接到采集系统的400 µm直径纤维光线贴片（Doric）连接到植入的光纤。然后在20分钟的记录中，在随机的时间内随机使用压电 - 电动执行器将五十张挠度（每次演示为2 s，每次演示2 s，每次演示2 s）。使用自定义MATLAB代码使用Arduino的MATLAB支持软件包来控制偏转正时。使用晶体管 - 透射逻辑（TTL）脉冲将事件与采集软件同步。
将大鼠（移植后140天以上）用5％的异氟烷进行麻醉，用于诱导，在手术过程中1-3％的异氟烷。将动物置于立体定位框架（KOPF）中，皮下施用丁丙诺啡SR和地塞米松。颅骨被暴露，清洁，并插入3-5个骨螺钉。为了靶向T-HCO，我们根据使用MRI获得的图像生成了立体定向坐标。用直接在移植的HCO上方的高速钻头进行圆形颅骨切开术（直径约为1厘米）。一旦骨头尽可能薄，但是在整个骨骼一直钻孔之前，使用镊子去除剩余的完整骨盘以揭示下面的T-HCO。颅骨切开术充满无菌盐水，并用紫外线固化的牙科水泥（Relyx）将玻璃盖玻片和定制的头杆固定在头骨上。
使用Nikon LWD物镜（×16，0.8 Na）使用Bruker多光子显微镜进行两光子成像。GCAMP6的成像以920 nm进行，×1.4在单个Z平面中进行缩放，其平均8×框架为7.5帧每秒。用5％的异氟烷对大鼠进行诱导，并用1-3％的异氟烷维持。将大鼠放入定制的头部固定装置中，并放在物镜下方。获得了3分钟自发活动的基线记录。然后，在20分钟的记录中，在随机的时间随机将五十个Airpuff（每次演示持续时间为100毫米）将其交付到T-HCO的晶须垫对侧。使用Arduino的MATLAB支持包使用自定义MATLAB代码来控制Airpuff时序。事件与使用TTL脉冲的采集软件（Prairieview 5.5）同步。为了进行分析，使用Moco中的仿射校正校正了X – Y运动的图像，在斐济运行。使用CNMF-E43提取从单个细胞的荧光痕迹。提取来自每个感兴趣区域的荧光，将转换为DF/F痕迹，然后转换为Z分数。
将大鼠（移植后140天以上）用5％的异氟烷进行麻醉，用于诱导，在手术过程中1-3％的异氟烷。将动物置于立体定位框架（KOPF）中，皮下施用丁丙诺啡SR和地塞米松。将与T-HCO对侧的晶须修剪成大约2 cm，并穿过与压电电动执行器耦合的网状。头骨暴露并清洁。将不锈钢螺钉固定在头骨上。为了靶向T-HCO，我们根据MRI获得的图像生成了立体定向坐标。用直接在T-HCO上方的高速钻进行圆形颅骨切开术（直径约1厘米）。一旦骨头尽可能薄，但是在整个骨骼一直钻孔之前，使用镊子去除剩余的完整骨盘以揭示下面的T-HCO。使用32通道或64通道高密度硅探针（剑桥神经科学）记录单个单元，该探针（剑桥神经技术）接地至地面螺钉，并用RHD放大器（INTAN）预先放大。通过操纵器将电极通过颅骨切开术降低到目标部位，并用无菌盐水填充颅骨切开术。通过开放的Ephys采集系统在30 kHz进行数据采集。仅当我们确定了具有高度相关的节奏自发活动的十个以上的通道时才进行记录，这表明电极位于移植物中（基于两光子钙成像数据）。获得了10分钟自发活动的基线记录。然后在20分钟的记录中，在随机的时间内随机使用压电 - 电动执行器将五十张挠度（每次演示为2 s，每次演示2 s，每次演示2 s）。使用自定义MATLAB代码使用Arduino的MATLAB支持软件包（MATLAB 2019b）来控制偏转正时。使用TTL脉冲将事件与采集软件同步。
为了进行选择，将直径为200 µm的直径纤维贴片线（Doric）耦合到473 nm激光器（Omicron），连接到位于颅底上方的200 µm直径光纤。在此之前，贴片线的功率输出调整为20 MW。通过操纵器将电极通过颅骨切开术降低到目标部位，并用无菌盐水填充颅骨切开术。在记录开始时，传递了10张473 nm光（在2 Hz的脉冲宽度为2 Hz）的脉冲。轻响应单元被定义为在70％或更多试验的轻度发作中显示出尖峰响应的单元。
为了进行分析，使用kilosort2对尖峰进行分类，并使用PHY2手动策划（参考文献44）。使用200毫秒的垃圾箱计算发射率，其滑动窗口为100 ms，并转换为Z分数。在人口活动中，使用具有两个状态的隐藏马尔可夫模型将“ ON”和“ OFF”状态标记。在状态上被认为代表爆发，并且被认为OFF状态代表爆发间隔。使用Baum -Welch算法拟合模型的发射过渡参数（MATLAB HMMTRAIN，收敛阈值为1×10–6，并且过渡矩阵的初始猜测：[0.95，0.05; 0.05; 0.05; 0.05; 0.05，0.96] and nistion：[0.5，0.5，0.1; 0.5，0.1，0.99]）算法。为了评估对晶须挠度的反应，进行了Wilcoxon签名的秩检验，以比较晶须偏转开始后1 s的发射速率与晶须偏转之前的1 s，并具有p的显着性阈值< 0.05. Latencies were computed as the time to reach peak z-score in the 2 s following whisker deflection. The power spectral density was calculated using Welch’s method (pwelch() in MATLAB), with a window slide of 10 × fs, where fs is the sampling rate of the signal.
Rats (more than 90 days after transplantation) were anaesthetized with 5% isoflurane for induction and 1–3% isoflurane during surgery. Animals were placed into a stereotactic frame (Kopf) and Buprenorphine SR was administered subcutaneously. The skull was exposed, cleaned and 3–5 bone screws were inserted. To target the t-hCO, we generated stereotactic coordinates based on the images acquired with MRI. A burr hole was drilled at the site of interest, and a fibre (200 μm in diameter, 0.48 NA; Thorlabs) was lowered to 100 µm below the surface of the hCO and affixed to the skull with UV-cured dental cement (Relyx).
Water scheduled rats (1 h of water per day) were placed into a custom operant chamber containing a nosepoke portal equipped with a lick spout for water reward delivery. Entries into the nosepoke portal were detected by the breakage of an infrared beam, and licks were detected using a capacitive touch sensor. All events were controlled and recorded using custom MATLAB code using the MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b). At least 1 week after surgery, animals began pre-training. On day 1 of pre-training, animals received small water rewards at the reward spout at randomized delays for 1 h. On days 2 and 3 of pre-training, animals received small water rewards only after performing increasing numbers of licks to the lick spouts for 1 h. All animals readily performed this behaviour. After pre-training, animals were trained to associate optogenetic stimulation of the transplanted hCO with reward delivery. Animals were placed into the operant chamber and a 200-µm diameter fibre-optic patch cord (Doric), coupled to both a 473-nm (Omicron) and a 635-nm (CNI) laser outside of the operant chamber, was connected to the implanted optical fibre. Immediately before this, the power output from the patch cord was adjusted to 20 mW. Laser timing was controlled by a Master-8 pulse generator (AMPI). One second after entering the nosepoke portal, animals received random presentations of either 473-nm or 635-nm stimulation (10 Hz with 10-ms pulse width for 5-s total stimulation). If animals performed one or more licks during the 473-nm stimulation, a small water reward was dispensed at the reward spout after stimulation was complete. The next trial was initiated after collection of this reward. If animals performed one or more licks during the 635-nm stimulation, there was no consequence. Trials were separated by a variable interval of 5–10 s. Animals received daily training sessions that concluded after 150 473-nm and 150 635-nm trials had been completed or after 150 min, whichever came first, for a total of 15 days. Behavioural performance was quantified by calculating a preference index for each training session: (number of licks during 473-nm stimulation − number of licks during 635-nm stimulation)/(number of licks during 473-nm stimulation + number of licks during 635-nm stimulation). The learning success rate was defined as the percentage of trained animals that achieved a preference score >至少连续2个训练日为0.2。
将大鼠置于干净的大鼠笼中，并将直径200 µm的直径纤维贴片线（Doric）耦合到473 nm（Omicron）激光器，并连接到植入的光纤。在此之前，贴片线的功率输出调整为20 MW。刺激的动物在返回回家之前接受了10 Hz，10 ms脉冲宽度和473 nm刺激10分钟。未刺激的动物在返回回家之前没有刺激10分钟。通过150 mL PBS的心心灌注对大鼠进行安乐死，然后在光遗传学刺激后100 mL 4％PFA。提取大脑，并在振动型上切割100μm的切片。将切片用山羊抗GFP（ABCAM）和兔抗FOS（ABCAM）主抗体标记，Alexa 488驴抗山羊（Invitrogen）和Alexa 594 Donkey Antikey抗兔（Invitrogen）二级抗体和DAPI。使用具有×20物镜的共聚焦显微镜（Zeiss）获取图像，并与来自Paxinos，George和Watson Rat Rat Brain Atlas的图像覆盖，用于指定大脑区域中FOS阳性细胞的手动计数。
用异氟烷和立体定位地将FOXN1 - / - 大鼠在双侧体感皮层和双侧运动皮层上用不锈钢线（791400，A-M Systems）植入立体定位。将参考线放置在小脑上，并用牙科水泥固定（metabond，S399，S371和S398； Jet Set4液体，Lang Dental，3802x6）。使用以下立体定向坐标，相对于Bregma：原发性体感皮层（S1BF），前骨前 - 1.3 mm和横向3.3 mm；和原发性运动皮层（M1），前侧+2.5毫米，侧向2.5毫米。将植入物的电线固定到定制的磨坊 - 最大头件适配器（ED90267-ND，Digi-Keyeled Electronics）上。为了启动录音，适配器连接到头阶段，由数字化器和放大器板（C3334，Intan Technologies）组成。醒着，自由行为的动物被束缚在带有轻量级SPI接口电缆（C3206，Intan Technologies）的采集板（开放式薄饼）上。连续实时的EEG使用开放的Ephys软件（版本0.4.4.1; https：//open-ephys.org）记录。将数据以2 kHz采样，并在1至300 Hz之间过滤带通通道。
在行为测试开始前连续5天处理大鼠（移植后90天以上，移植后90天以上）处理3分钟。将大鼠放入一个开放田活动竞技场的角落（43 cm×43 cm×30 cm），其中包含三个在声音衰减室内的红外探测器（Med Associates）。允许大鼠探索竞技场10分钟，并使用Med Associates软件计算移动的距离。每个会议结束时，用1％的维尔康解决方案清洁了竞技场。
在此测试中，使用了两个不同的物体（绿塔和白瓶）。这些物体的高度和体积相似，但其形状，质地和外观有所不同。在第1天，将大鼠放入黑色方形塑料区域（50 cm×50 cm×45 cm），并允许探索带有两个习惯物体（15 ml离心管）5分钟的竞技场。在第2天，大鼠首先进行了训练。在本次会议中，将大鼠放入竞技场，并允许用两个相同的物体探索竞技场5分钟，这些物体被放置在距角15厘米外的对角线相对角中。然后将大鼠送回他们的归乡5分钟。在测试过程中，将大鼠放回竞技场5分钟，其中两个物体之一被一个新物体代替。通过自动跟踪系统（Noldus Information Technology）跟踪大鼠，与每个对象进行互动所花费的时间是由对实验组视而不见的实验者手动评分的。相互作用定义为大鼠将其鼻子指向其2 cm之内的物体。对训练和测试的对象以及这些对象的位置进行了伪态。在每个培训和测试课程结束时，用1％的Virkon解决方案清洁了物体和竞技场。歧视索引被计算为（与新对象进行互动的时间 - 与熟悉对象进行交互的时间）/（在测试过程中花费的时间与新的对象 +与熟悉对象交互的时间互动）。
该实验包括1天的培训，1天的上下文恐惧测试和1天的提示恐惧测试。培训和上下文测试都使用了相同的上下文。这种情况有铝制墙壁，灰色金属网格，用于地板，黄色房屋的灯光和薄荷提取物的气味，并用大鼠（库尔恩仪器）之间的10％简单的绿色溶液清洁。提出的恐惧测试环境是圆形的，上面有塑料墙和地板，蓝房子的灯和香草提取物的气味，并用大鼠之间的70％乙醇清洁。在第1天（训练），将大鼠单独放入训练室200 s。提出了音调（20 s，80 dB，2 kHz），然后在音调结束后18 s的电击（在2 s的持续时间为0.5 mA）。在冲击结束和随后音调的开始之间，该过程总共重复三次，间隔为60 s。在最后一次冲击后，将大鼠从房间中移开，并返回他们的寄宿家庭60秒钟。在第2天，将大鼠放回训练环境中，没有任何音调或震动5分钟以进行上下文记忆测试。在第3天，将老鼠置于提示的恐惧环境中。经过200 s的习惯后，将大鼠以80秒的间隔给大鼠带有三次的音调（20 s，80 dB，2 kHz）。使用Freezeframe软件控制刺激呈现。高架摄像头用于记录行为。冻结行为是由对实验组视而不见的实验者手动评分的。冻结被定义为除了呼吸引起的动作外，没有所有运动。
除非另有说明，否则数据表示为平均值±S.E.M.。原始数据的分布测试了分布的正态性。使用学生的t检验，kolmogorov – smirnov检验，Wilcoxon签名的秩检验或Bonferroni校正进行多个比较的方差分析，进行统计分析。统计分析在Prism（GraphPad）和OriginPro（OriginLAB）中进行。补充表7中包含每个图面板的完整统计细节。除非另有说明，否则重复了来自代表性实验的数据，并在至少三个独立的生物学重复中重复了相似的结果。根据先前的研究，从经验上估算样本量。将HCO随机分配到不同的实验。行为实验是由对实验条件视而不见的研究人员进行的。
所有涉及人类细胞的实验都符合所有相关指南和法规。在这项研究中，人类捐助者同意使用其细胞来产生臀部细胞和衍生细胞。补充表1列出了细胞及其机构批准的来源。这项研究还受益于斯坦福法律中心和关于工作的伦理方面的磋商，这是斯坦福大学脑器官发生的大型想法项目的一部分（斯坦福·瓦泰泰神经科学研究所）。从斯坦福实验室动物护理（APLAC）研究合规办公室获得了将HCO移植到大鼠中的批准。在移植动物中未检测到可见的运动或记忆缺陷，并且整个过程都受到监测。经斯坦福大学机构审查委员会的批准，获得了手术神经组织样本。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。