所有动物护理和实验程序均获得韩国高级科学技术研究所（KAIST）（KA2023-014-V1）和密苏里大学（9797）的机构动物护理和使用委员会（9797）的批准。

　　C57BL/6J小鼠（8至12周）购自DBL或JAX。从韩国基础科学研究所的老化科学中心或JAX购买了老年C57BL/6J小鼠（年龄73至102周）。Prox1-GFP小鼠18（成人）（成人）和73至102周（年龄））在KAIST的无特定病原体条件下繁殖并维持。所有供应获得标准饮食和水的小鼠在23-24°C和40–60％的湿度下在12 h – 12 h的光线周期下繁殖。两性的小鼠均用于所有实验。小鼠通过腹腔注册。在手术之前或之后，注射麻醉药（每公斤氯胺酮为80 mg，每公斤80毫克）或氨基甲酸酯（每公斤1.5毫克）的混合物。使用生理监测系统（哈佛设备75-1500）测量小鼠的心脏和呼吸率。在整个手术和成像过程中，体温保持在36.5–37.5°C。所有实验均在光期间进行。在Kribb国家灵长类动物中心尸检期间，收集了灵长类动物的头部和颈部部分（6-13岁）。

　　为了获取鼻咽内CSF流出的浸润图像，深宫淋巴结和淋巴结，3μl包含TMR – dextran的PB（10 kDa，50 kDa，50 mg -ml -1或70 kDa或70 kDa，25 mg ml -1; Invitrogen in -1; Invitrogen，d1816 insir in 1.0 in Min in Minun in 1.0 minun in Minun in Minun in Minun in Minun in Minul in 1.0 ni Minul in Minul in Minul in Minul in Minul in Minul in Minul in Minul in Minul in Minul通过Prox1-GFP或C57BL/6J小鼠的Cisterna magna腔。为了开始此过程，将一只麻醉的小鼠放在手术显微镜下的立体定位框架上的俯卧位置。借助烟嘴将头部与体轴的角度调节90°角，以促进进入甲壳虫的麦格纳。在后颈中线切开皮肤后，将肌肉层小心地用显微镜分离。使用33号纳米针（World Precision Instruments）在表面上渗透到上覆盖甲壳虫的大亚特兰托 - 枕膜，然后使用1μlmin-1 min-Minife（100 min-Minofie）（8880 000 000 000 000，Hamil（8880000），将含有TMR-DEXTRAN的PBs注入含TMR-DEXTRAN的PBS，将TMR – DEXTRAN注入1μlMin-1的亚蛛网脉络固醇空间中。Chemyx）。将针在位置放置10分钟，然后从小鼠中慢慢移开，以防止CSF泄漏。然后用6-0黑色丝绸（Ailee，SK617）缝合肌肉层和颈部皮肤。或者，i.h.注入了。为了设置此过程，在颅骨在立体定位框架上暴露后，在内侧 - 侧轴1 mm处钻了一个小孔，相对于前轴 - 前轴 - 1.5 mm。连接到PE-20导管的定制玻璃移液（直径为20μm）被插入到2 mm的深度。使用微音误和微型输注机将含有TMR – dextran的PBS（300 nL）以100 nl min-1的速度注入海马，3分钟。输注后，将玻璃移液放在适当的位置5分钟，以防止回流，然后慢慢去除。用树脂和超亮的混合物将孔密封。输注后，切开腹主动脉以去除血液， 在进行颈部皮肤中线切口后，剖析了胸骨骨骨体和半髓样肌肉，并在手术显微镜（SZX16，Olympus）下缩回。在此步骤中，精确成像需要进行解血，以防止颈部肌肉大规模解剖的血液遮盖图像场。然后仔细暴露在长山脉肌肉上的DCLN和鳞肌肌外侧的宫颈淋巴管。通过解剖咽肌肉和二胃肌之间的空间，暴露了与腹神经相邻的内侧宫颈淋巴管。在头顶方向上进行了进一步的解剖，以从鼻咽部到内侧宫颈淋巴管以及从颈孔到外侧宫颈淋巴管的重要成像。为了确保适当的放置，将24口径的聚乙烯导管（Angiocath Plus，BD，382412）插入颈孔中。为了直接访问鼻咽，将下颌骨较低，然后将柔软的口感剥落。然后从鼻咽的腹侧和背侧捕获了通过NPLP的TMR – dextran流出。使用荧光立体变焦显微镜（AxioZoom V16，Carl Zeiss）捕获指示区域的插入图像，该图像具有带有HE-GFP或CY3滤波器（Carl Zeiss）的Plan-Neofluar Z×1.0物镜。切割腹主动脉后的5分钟内，进行了该围栏成像的整个过程。

　　总共3μl的流体流动微粒溶液（直径为0.5 µm；聚苯乙烯，羧酸盐改装的表面，红色荧光（580/605），2％固体98％的98％干重，Thermo Fisher Scientific，Thermo Fisher Scientific，F8887）或3μLTexas-Red-Ref-conjugated Ovalbimin（5 mlo）（5 mlo）o21 ro ovalbimin（5 ml）。将科学）在1.0μlmin-1中注入3分钟中，将其在甲米氏菌的Prox1-GFP小鼠的蛛网膜下腔空间中注入。随后，按照下面的“组织准备分析的组织制备”部分中所述收集头部进行组织学分析。A total of 3 μl of AAV9-VEGF-C-mCherry (AAV9-275994-mCherry, Vector Biolabs) or AAV9-mCherry (7107, Vector Biolabs), with a concentration of 1 × 1013 gene copies per ml in PBS was infused into the subarachnoid space of Prox1-GFP mice at the cisterna magna at 1 μl min−1 over3分钟。输注后3周，类似地注入了TMR – dextran，随后在DCLN中测量了其荧光。此后，除去鼻咽，隔膜和硬脑膜以进行组织学分析。为了确定深宫颈淋巴管的哪一侧是CSF流出的原因，在10周龄的Prox1-GFP小鼠中，用10-0聚丙烯缝合线（W2794，Ethicon）用10-0聚丙烯缝合线（W2794，Ethicon）绑扎内侧或外侧宫颈淋巴管。对于假对照组进行了同一操作，没有连接。然后，24小时后，I.H.进行浸泡成像。输注TMR – dextran。为了检查药理学剂对通过深宫颈淋巴管或DCLN的CSF流出的影响，在TMR – DEXTRAN内注入后，暴露了内侧宫颈淋巴管，并用100μLPBS浸入100μLPBS。基线成像3分钟后，苯丙胺（10 nm，1μm，50μm，500μm或5 mm），硝化钠（3μm，30μm或25 mm）或在100μL的PBS中无需施加3分钟的PBS 然后用PBS洗涤。然后测量深宫颈淋巴管的直径和TMR – dextran荧光20-30分钟。TMR – dectran荧光在TMR – dextran肠内输注后30分钟也在DCLN中测量。将所有值归一化为平均基线值。

　　老年Prox1-GFP小鼠（70-88周）注射200 µg I型抗Interferon信号传导阻断抗体（抗IFNAR-1抗体；抗小鼠干扰素α/β受体亚基1抗体，BE0241，Bioxcell）或200 µG小鼠IgG小鼠IgG同型控制（BE0083，Bioxcell），每72周6周，供6周6周。通过测量成年成年鼻咽组织（10-14周）C57BL/6J小鼠的鼻咽组织中，通过测量干扰素刺激的基因OAS2和MX2的mRNA表达来验证抗体的阻塞效应。在I.P.之前1小时，用200 µg抗IFNAR-1抗体或IgG预处理小鼠。2'3'-CGAMP（300 µg，TLRL-NACGA23-5，Invivogen）或PBS，并在4小时后收集组织。

　　为了获取矢状截面图像（对于图1B），在塞司孔塞肠内输注TMR – dextran后60分钟，在C2椎骨水平上切开Prox1-GFP小鼠的头部和颈部，并在切割腹部主动脉以去除血液后立即采样。然后用刀片将样品切成一半，并用荧光立体变焦显微镜（AxioZoom V16，Carl Zeiss）捕获图像，并使用Plan-Neofluar Z×1.0物镜用HE-GFP或CY3 Filter（Carl Zeiss）捕获图像。为了进行免疫荧光染色分析，在右心房穿刺后，将冰冷的PBS灌注到左心室中以去除血液。然后，通过左心室注入4％多聚甲醛（PFA）溶液以固定组织。为了进行整体制剂，对周围肌肉进行了DCLN和附着的传入淋巴处理。通过在手术显微镜下使用精细的镊子和手术显微镜去除周围的头骨，神经和软组织来分离鼻咽粘膜。将收集的组织用2％PFA溶液在4°C固定2小时。对于小鼠头的冷冻截面，将头部浸入2％PFA溶液中，在4°C下进行12小时以进行固定后。随后，将样品在4°C下浸入0.5 m EDTA溶液中48小时以进行脱钙化，通过将30％蔗糖溶液浸入48 h 4°C下48 h，嵌入并冷冻在冷冻截面培养基（leica）中，并使用30μm切片切成30μm的切片（使用Cryocut Microtome（Leica））。对于组织清除，将4％PFA灌注的头部在4％PFA中进一步浸入4°C，以进行固定后，用PBS洗涤，并在三次CI溶液（TCI，T3740）中孵育，每天在37°C下进行7天的变化7天。组织清除和PBS洗涤后，将样品进行脱钙化，免疫荧光染色和成像。为了准备灵长类动物， 将动物灌注冰冷的盐水，然后斩首。用4％PFA固定头部样品2 h，在4°C下固定2％PFA。随后，将样品用0.5 m EDTA脱钙，在4°C下持续3周。每4天将样品放入新鲜的EDTA溶液中。沿以下组织边界修剪了脱钙的头部：前（Choana），后骨（枕骨），背神经（视神经）和腹侧（尿布）。修剪样品沿着矢状平面切成两半，并从头骨上去除大脑。为了进行整体式制剂，将鼻咽粘膜仔细地与颅底分开，柔软的口感。

　　在室温下，将样品在5％的正常驴血清（017-000-121，杰克逊免疫学）中孵育1小时。接下来，将样品与原代抗体（1：400）在4°C下溶解在5％正常驴血清中12小时。在PBS洗涤后，将样品与二抗（1：1,000）在4°C下溶解在5％的正常驴血清中12小时。在室温下将用于清除和脱钙的样品与驴血清一起孵育24小时；然后，在室温下以1：200稀释的原发抗体持续10天；最后，在室温下以1：100稀释的二级抗体持续3天。PBS洗涤后，样品覆盖了含DAPI的安装介质（H1200，载体）或折射率匹配溶液（D-Protoss）61。The primary antibodies used were as follows: anti-LYVE1 (rabbit polyclonal, 11-034, Angiobio), anti-CD31 (hamster monoclonal, 2H8, MAB1398Z, Merck), anti-VE-cadherin (goat polyclonal, AF1002, R&D), anti-VEGFR3 (goat polyclonal, AF743, R&D),抗αSMA-CY3（小鼠单克隆，1A4，C6198，Sigma-Aldrich），抗β3微管蛋白（小鼠单克隆，2G10，AB78078，ABCAM，ABCAM），抗FOXC2（抗foxc2IV型抗胶原（山羊多克隆，AB769，默克），抗层氨基蛋白α5（兔多克隆，EWL004，kerafast），抗酪氨酸羟化酶（兔羟化酶（Rabbit抗磷酸-TAU（小鼠单克隆，AT8，MN1020，Thermo Fisher Scientific），抗甘露糖受体（CD206，兔多克隆抗体，AB64693，ABCAM），抗PTX3（兔多克隆抗体，ALX-210-365-C0505050，ENZO LIFESCESCE）。使用了以下二级抗体：Alexa Fluor 488-，594-和647-共轭抗兔（711-545-152，711-585-152，711-605-152，711-605-152），抗goat（705-585-147），705-585-147），抗shep（713-585-147）（127-605-160） 二级抗体（Jackson Immunoresearch）在4°C下阻止缓冲液过夜。这项研究中使用的所有抗体均由指定的制造商验证了物种和应用。

　　为了检测鼻咽中的凋亡细胞，根据制造商的说明（12156792910，Merck）进行了末端脱氧核苷酸转移酶生物素-DUTP Nick End标记（TUNEL）测定法。

　　使用LSM800或LSM880共聚焦显微镜（Carl Zeiss）获取免疫荧光图像。Zen（V.2.3）软件（Carl Zeiss）用于获取和处理图像。整个组织或组织部分的共聚焦图像是整个组织厚度的瓷砖或单平面Z堆栈图像的最大强度投影。所有图像的分辨率为512×512或1,024×1,024像素，并以以下目标获得：空气目标Plan-Apochromat×10/0.45数值孔径（Na）M27​​和Plan-Apopomat M27和Plan-Apophromat×20/0.8 Na M27;LD C-Apochromat×40/1.1 Na Immermersion Corr M27（LSM 880）在框架中进行多通道扫描。使用浅层荧光显微镜（LSFM，Carl Zeiss）成像，以EC计划 - 纽瓦尔×5/0.16镜头对进行组织清除和脱钙化的样品进行成像。使用ImageJ软件（NIH）或ZEN软件（Carl Zeiss）对最大强度预测共聚焦图像进行形态测量。The PROX1+ lymphatic area and the number of lymphatic valves and detached LECs were measured on the dorsal side of the nasopharynx at the following boundaries: anterior (most posterior part of posterior nasal lymphatic plexus), posterior (Eustachian tube), and lateral (a perpendicular line from Eustachian tube to nasopharyngeal淋巴管）。手动计数淋巴瓣和分离的LEC的数量。VEGFR3和LYVE1的信号强度在该区域的鼻咽背侧（1.5 mm×3 mm）测量 由上述边界定义。每个样品中的四个500μm×500μm随机场中分析隔膜中的prox1+淋巴面积。在每个样品旁窦汇合处的四个400μm×800μm场中分析了上矢状窦周围的prox1+淋巴区域。如前所述15，在200 µM×200 µM中分析了鼻咽淋巴管内皮细胞的VE-钙粘蛋白+连接模式。纽扣状的连接定义为不连续的点状线间连接，而拉链状连接处则定义为连续的细胞间连接。不匹配这两种模式的连接被归类为混合类型。手动测量了深宫颈淋巴管中淋巴瓣的数量和淋巴管的长度。使用ImageJ插件的WEKA可训练的分割，在每种深宫颈淋巴管的三个淋巴管中测量每个淋巴管的αSMA+平滑肌覆盖率。在鼻咽淋巴管的背侧的1 mm×1 mM区域中测量磷酸化的TAU。对TUNEL阳性细胞进行计数，并表示为在鼻咽淋巴管的背侧随机选择的两个随机选择的150 µM×150 µm场中的总LEC百分比。

　　小鼠通过腹腔注册。注射氯胺酮 - 二甲苯并将面部朝上放在加热的组织解剖/隔离垫上。从脖子到胸骨，在皮肤上进行了近端到远距离切口。在修剪松散的facia时，将小鼠一侧的下颌腺和胸腺用小夹子缩回，以暴露于DCLN上的气管和肌肉。使用细镊子和显微镜去除内侧宫颈淋巴管的0.5–1.5毫米长段，并转移到含有克雷布斯溶液+0.5％BSA的盘子中。该过程在动物的另一侧重复。然后将两种深宫颈淋巴管固定在室温下，在室温下装有krebs-bsa缓冲液的Sylgard涂层室中，将短片段用40 µm不锈钢线的短段固定在塞尔加德涂层的解剖室中。通过微分解去除周围的脂肪和结缔组织。然后将隔离的DCLV转移到Zeiss倒置显微镜阶段的3 mL观测室中，使用两个玻璃微孔（50-60 µm外径）加压为1 CMH2O。随着血管加压，将片段清除为剩余的结缔组织和脂肪组织。聚乙烯管连接到每个玻璃微孔的背面，并连接到计算机压力控制器，并独立控制流入和流出压力。为了最大程度地减少与纵向弯曲时的直径跟踪伪像，在每个实验开始时，将输入压力和输出压力短暂升至10 cmh2o，并轴向拉伸容器段，以去除任何纵向松弛。在此过程之后，每个DCLV被允许在37°C的压力设置为1 CMH2O的情况下平衡。使用蠕动泵以0.5 ml min -1的速率维持KREBS缓冲液的恒定交换。温度稳定后的30分钟内，一些血管开始表现出自发收缩。自定义LabView程序 （国家仪器）通过A-D接口（国家仪器）获得了实时模拟数据和数字视频，并检测到了船只的内径63。记录了使用Firewire摄像头（Basler，Graftek Imaging）在30 fps下记录淋巴管的收缩活性以在30 fps下进行进一步分析。

　　为了评估对压力压力的生理反应，深宫颈淋巴片段的腔内压力从1降低至0.5 cmH2O，然后升至1、2、3、5、8和10 CMH2O，同时在每个压力下记录内径1-2分钟。输入压力和输出压力都保持在相等的水平上，因此没有施加的向前流动压力梯度。将压力恢复到1 CMH2O 5分钟后，将苯肾上腺素施加到累积浓度上，同时在每种浓度下记录直径1-2分钟。一旦达到了最大水平的音调（通常为被动直径的40-50％），以累积的浓度施用二乙胺非盐酸钠水合物（非对钠，默克钠，默克钠），同时测量每个浓度的直径。在每个实验结束时，通过灌注含有3 mM EGTA的无钙KREBS缓冲液进行灌注，持续30分钟，并在每个肺内压力的每个水平上获得无源直径。

　　鼻咽组织用于与成年性别（n = 30）和老年（n = 25）小鼠的性别分离。麻醉后，将小鼠用冰冷的PB灌注，并去除鼻咽粘膜并在DMEM/F12培养基（Gibco）中合并。将组织切成小块，并在含有1 mg ml -1的胶原酶IV（Roche），1 mg ml -1的分离酶（Gibco）（Gibco）和0.1 mg ml -1 DNase I（Gibco）的分离缓冲液中孵育37°C，每10分钟温和倒入30分钟。通过70 µm的滤网过滤消化的样品，并添加2％FBS以停止消化。将细胞在500G下离心8分钟，并用PBS重悬于洗涤。为了排除死细胞，将1：1,000的幽灵染料（Tonbo Bioscience）添加到重悬的细胞中，在4°C下持续15分钟。然后添加PBS进行洗涤，然后用PhycoeryThrin/cy7抗小鼠CD326（EP-CAM，G8.8，118216，Biolegend）抗体，APC抗小鼠Podopplanin抗体（8.1.1，127410，Biolegend，Biolegend）和phycoerythrin-ant-antimouse-anti-anti-anti-anti-anti-anti-ant-anti-anti-anti-anti-anti-anti-ant-anti-anti-anti-anti-anti-anti-anti-anti-anti-mouse cD331313102508，Biolegend）。CD31+ PDPN+细胞被认为是LEC，并使用FACS ARIA Fusion（Beckton Dickinson）系统进行分类。排序的LEC直接放入装有裂解缓冲液的96孔板中的每个孔中。板用液氮冷冻，并储存在-80°C下。遵循Smart-Seq3协议64，生成了基于板的单细胞库。简而言之，裂解细胞的mRNA反转录。使用Ampure XP珠（Beckman Coulter）扩增cDNA并纯化。将纯化的cDNA稀释（100 pg µl-1），并使用Nextra XT XT DNA文库制备试剂盒（FC-131-1024，Illumina）中包含的TN5转座酶进行标记。使用自定义索引引物，将标记的产品放大，然后汇集到单个管中。最终使用Ampure XP珠的清理后， 使用挂接进行质量控制对图书馆进行了分析。通过质量控制检查的图书馆在Illumina High-X平台上进行了测序。

　　测序的文库被列出并与Star（V.2.7.9.a）对齐小鼠参考基因组（MM10）。使用子读包中的featurecount（v.2.0.1）函数用于合并对齐的文件并构建原始读取计数矩阵。对于细胞质量控制，用少于2,000个基因和细胞检测到的细胞超过10％的总读数映射到线粒体基因被认为是低质量/死细胞，并被丢弃。在基因水平上，从少于三个细胞中表达的基因从表达基质中除去。

　　为了聚类和可视化单细胞，使用了R包seurat（v.4.1.0）。简而言之，将每个计数的每个计数用于单元格中的每个计数除以给定单元中的计数总数，并乘以1×104，并添加1个伪金。因此，将最终的表达矩阵转换为具有类似于对数转换的值的值。然后，使用FindVariableFeatures功能选择以下选项：Selection.Method =“ VST”，选择了每个数据集的最高可变性的前2,000个基因。将这些高度可变的基因缩放和居中，同时回归混杂变量，例如总数数量和映射到线粒体基因的读数百分比。此外，使用addModulesCore函数计算解离诱导的基因和核糖体基因的模块得分并进行了回归。

　　为了在二维空间中进行可视化，进行了主成分分析，并将前15个主要成分用作UMAP分析的输入。对于邻里识别和集群分配，使用前15个主要组件并应用了Louvain算法，建立了共享最近的邻里图。为了识别细胞之间的差异表达基因，我们使用了Seurat中的Findmarkers功能，并具有以下选项：test.use =“ mast”，logfc.threshold = 0.3，min.pct = 0.3。在进行鉴别表达测试时，我们排除了分离诱导的基因，线粒体和核糖体基因。在合并成人和老年小鼠数据集时，未使用批处理方法，因为没有观察到聚类的明显批处理效应。

　　根据标准功率计算（α= 0.05，功率为0.8）选择样品量，并且没有使用统计方法来预先确定样本量。实验是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中对分配视而不见。使用Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov的单样本测试对数据进行了正态性测试。根据数据分布，使用了参数或非参数统计。差异的统计意义是使用两尾学生的t检验，两尾韦尔奇的t检验确定的，棕色 - 福利方差分析，双向方差分析测试或两尾曼恩 - 惠特尼U-测试。在比较两组之间的时间序列数据时，使用了双向重复测量方差分析。使用Prism 10（GraphPad Software，v.10.1.0）进行统计分析。所有数据均表示为平均值±S.E.M.统计显着性设置为p <0.05。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。