人型进化代表着灵长类动物进化中的扩展阶段，涉及许多表型变化和广泛的基因组序列变化。因此，查询整个基因组的人种特异性突变会导致数千万候选者，其中大多数在非编码区域处置。我们使用以下标准来定义候选变体可能有助于人类类似的尾部损伤进化：（1）必须是类型的特异性人类，这意味着变体序列或氨基酸是人型物种独有的，并且不能由任何其他具有尾巴的物种共享；（2）相关基因的功能与尾部发育有关。从MGI表型数据库中收集了脊椎动物中与尾形开发相关的基因，MGI数据库未涵盖的其他文献。最初的分析主要涵盖了从MGI术语MP0003456提取的基因，用于“不存在的尾巴”表型（https://www.informatics.jax.org/vocab/vocab/mp_ontology/mp_ontology/mmp:0003456），总计为31个基因。其他分析包括来自MP0002632的基因，用于“残留尾巴”（https://www.informatics.jax.org/vocab/vocab/mp_ontology/mp:0002632）和mp0003456和“短尾巴”（https://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/mp:0000592）。总之，与脊椎动物尾部发育相关的最终基因清单包括140个基因（从2023年2月的MGI更新开始），据报道其突变与减少尾型表型有关（补充数据1）。

　　从Ensembl 109（https://useast.ensembl.org/info/info/data/biomart/index.html）下载了140个基因的基因结构注释。为每个基因选择了最长的带有大量外显子的转录本。从UCSC基因组浏览器下载了27种灵长类动物的基因组序列的多Z30Way对齐。我们选择了所有六种人型物种（HG38，Gorgor5，Pantro5，Panpan2，Ponabe2和Nomleu3）来计算一个同性异体传感序列，并使用了两个非类固醇物种（猪尾猕猴，macnem1，macnem1和marmoset，caljac3，caljac3，caljac3）。使用BedTools（V.2.30.0）52从Multiz30way对齐中提取了8种的140个基因的同源区域，以及上游和下游序列的10,000 bp。使用以下参数鉴定了类似的特异性变体：SNV或六种类种类的SNV或取代，但在两个外群猴子中的任何一个中有不同的差异为推定的类种类似的特异性SNV（补充数据2）；在所有六种类型种类的种类中存在的DNA序列，但在两个外猴种类中的任何一个中都没有将其鉴定为人类特异性插入（补充数据3）；和所有六种类型种类的DNA序列和DNA序列中，但在两个外猴种类中都存在为人类特异性缺失（补充数据4）。值得注意的是，我们分析人种特异性变体的标准可能包括一小部分假阳性命中，这些命中是特定于群体的变体。

　　我们使用了Ensembl变体效应预测因子（在Ensembl 109）53中进行了推断检测到的人素特异性SNV，插入和删除的潜在功能影响。由于缺乏祖先基因组作为参考序列，因此使用人/肉体类基因组序列作为参考等位基因呈负效应预测预测，而外群序列是替代等位基因。SNV被注释为“有害”（<0.05) in the SIFT score or ‘damaging’ (>在多键评分（53个实例）中，收集了影响蛋白质序列的插入（6个实例）或缺失（2个实例）中的0.446）收集了跨物种的进一步手动检查比较。在UCSC基因组浏览器比较基因组模块中，在241种基因组的仙人掌比对中进行了此额外检查。这项检查发现，可能影响宿主基因函数的大多数注释变体分为三类：（1）特定于群体的变体；（2）次要转录本中变体函数的假阳性注释；（3）在类型物种中的错义变体，但至少在另一种尾部物种中共享相同的氨基酸。这些变体不被视为可能影响人种类似的尾部损伤进化的候选者。除了这些变体外，我们将九种变体确定为真实的型型型编码区突变，包括七个SNV和两个插入和缺失（补充数据1）。在确定了顶级候选者之后，从NCBI数据库下载了代表性脊椎动物物种之间的蛋白质序列对齐，并使用Mega X软件和默认设置使用肌肉算法进行分析。54。

　　人类TBXT外显子5 – Intron 5 – Exon 6 – Intron 6 – Exon 7序列的RNA二级结构预测通过RNAfold（v.2.6.0）通过Viennarna Web服务器（http://rna.tbi.univie.univie.ac.ac.ac.at/)35进行。该算法使用具有默认参数的最小自由能矩阵来计算折叠概率。此外，计算包括分区函数和基础配对概率矩阵。值得注意的是，人类TBXT转录本被注释为5'未翻译区域外显子，使其外显子数与包括小鼠在内的大多数其他物种不同。为了简化，我们将人类TBXT的第一个编码外显子称为外显子1，因此将替代剪接外显子作为外显子6，与鼠标TBXT一致。RNA二级结构预测使用此顺序后使用从外显子5到外显子7的DNA序列。

　　分销商Wicell使用短串联重复分析来验证人类ES细胞（WA01，也称为H1，来自Wicell Research Institute）。将人类ES细胞在涂有人类ES细胞质量凝胶的组织培养级板上的无饲料条件下培养（Gibco，A1413302）。Geltrex在DMEM/F-12（Gibco，11320033）中稀释1：100，补充了1×谷氨酸（100x，Gibco，35050061）和1％Penicillin-stroptypomycin（Gibco，Gibco，15070063）。在播种人ES细胞之前，将板在组织培养培养箱（37°C和5％CO2）中用胶质的工作溶液处理至少1小时。

　　根据制造商的协议，使用STEMFLEX培养基（Gibco，A3349401）在无饲料条件下进行人体ES细胞维护和培养。简而言之，通过将STEMFLEX基底培养基（450 mL）与50 mL的STEMFLEX补充剂（10×）加1％青霉素 - 链霉菌蛋白结合在一起，制成了STEMFLEX完整培养基。将每个在6孔板上涂层的凝胶涂层均可在3-4天内播种200,000个细胞，以获得约80％的汇合。人类ES细胞在PSC冷冻膜中冷冻保存（Gibco，A2644601）。当细胞经过压力条件（例如冰冻和脱落或核反射）时，将培养基补充1×Revitacell（100×，Gibco，A2644501），也包括在PSC Cryomedium Kit中。第二天，Revitacell补充培养基被常规的STEMFLEX完整培养基取代。在修订环境下生长的人类ES细胞可能会伸展，但在返回正常的STEMFLEX完整培养基后会恢复。在我们常规的基于PCR的支原体测试中，所有人类ES细胞系均测试阴性。

　　人类ES细胞分化测定法诱导原始条纹状态的基因表达模式，改编自先前发表的方法36。在第-1天，使用VerseNe Buffer（与EDTA，Gibco，15040066）分解成新鲜培养的人ES细胞菌落成团（2-5个细胞）。将解离的细胞在茎flex完整培养基中的每CM2（6孔板中0.25 m）的胶状涂层的6孔组织培养板中播种，每CM2的25,000个细胞（在6孔板中为0.25 m）。通过将STEMFLEX完整培养基切换为基础分化培养基，在第二天（第0天）启动了与原始条纹状态的分化。使用48.5 mL DMEM/F-12，1％谷氨酸（500 µL），1％ITS-G（500 µL，Gibco，41400045）和1％青霉素 - 链霉菌素（500 µL），并补充了3 µmmmmmmmmmmmmmb3的0.mm gribitor CHIR，使用48.5 mL DMEM/F-12，1％grutamax（500 µL），1％ITS-G（500 µL，Gibco，41400045），并补充了15 µmmmmmmmm，在DMSO中； Tocris，4423）。在分化的第1至3天进行下游实验，该细胞被收集，这证实了在3天的分化周期36中中胚层基因（TBXT和MIXL1）的表达波动（扩展数据图3）。

　　源自C57BL/6J小鼠菌株的小鼠ES细胞系（MK6）是从NYU Langone Health啮齿动物基因工程实验室获得的。野生型MK6小鼠ES细胞系通过其在喂食器细胞依赖性条件上培养的培养后，然后进行胚胎注射的能力来验证其对胚胎的能力。根据实验的目的，在本研究中使用的MK6小鼠ES细胞在饲养依赖性和无饲料培养条件下均培养。所有小鼠ES细胞系在我们的常规定量基于PCR的支原体测试中均测试阴性。对于依赖小鼠ES细胞培养条件，将小鼠ES细胞铺在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞的预种子单层上（Cellbiolabs，CBA-310）。通过在用0.1％明胶溶液（EMD Millipore，ES-006-B）处理的组织培养板中，在每CM2的50,000个细胞中播种50,000个细胞来制备MEF涂层的板。MEF培养培养基由DMEM（Gibco，11965118）制成10％FBS（Geminibio，100-500），0.1 mm MEM非必需氨基酸（Gibco，11140050），1倍谷氨酰胺（Gibco，35050061）和1％conicillin – Streptepthepthepthepthepyclosin（Gibcoco，1506），15077777777777777.1507777777777777.小鼠ES细胞培养基由敲除DMEM（Gibco，10829018）制成，其中包含15％（v/v）FBS（Hyclone，hyclone，sh30070.03），0.1 mmβ-马ercaptoethanol（Gibco，31350010），1×MEM非含量氨基酸（Gibco，Gibco，Gibco，Gibco，Gibco，1114140050），1×11400000）35050061），1×核苷（Millipore，ES-008-D）和1,000单位ML – 1 LIF（EMD Millipore，ESG1107）。

　　对于无饲养小鼠ES细胞培养条件，将细胞在室温下与小鼠ES细胞合并的0.1％明胶（EMD Millipore，ES-006-B）预先涂层的组织培养级板上生长，至少30分钟。在播种小鼠ES细胞之前，将无馈物小鼠ES细胞培养培养基添加到明胶处理的板上，并在37°C和5％CO2孵化器中加热至少30分钟。不含馈线的小鼠ES细胞培养培养基，也称为'80/20'培养基，包括80％2i培养基和上述小鼠ES细胞培养基的20％。The 2i medium was made from a 1:1 mix of Advanced DMEM/F-12 (Gibco, 12634010) and Neurobasal-A (Gibco, 10888022), followed by adding 1× N2 supplement (Gibco, 17502048), 1× B-27 supplement (Gibco, 17504044), 1× Glutamax (Gibco,35050061），0.1mMβ-羟基乙醇（Gibco，31350010），1,000个单位ML – 1 LIF（Millipore，ESG1107），1 µM MEK1/2抑制剂（Steamgent，PD0325901）和3 µm GSK3抑制剂gsk3抑制剂Chiritor Chir999999999999999999999999999999999999999999021（tocris）。

　　用于诱导TBXT基因表达的小鼠ES细胞分化方案是根据在无馈物细胞条件下先前描述的方法改编的37。首先将细胞在80/20培养基中铺在明胶涂层的6孔板上24小时，然后将细胞切换到没有LIF的N2/B27培养基或2i培养基的N2/B27培养基。N2/B27培养基（50 mL）是用18 mL晚期DMEM/F-12，18 mL Neurobasal-A，9 ml敲除DMEM，2.5 ml敲除血清替代品（Gibco，10828028）（10828028），0.5 ml N2补充，1 ml B27补充，0.5 ml und cunt uce，0.5 ml lutlamax，0.5 ml lutl amax，0.5 ml lutl amax，0.5 ml lutl amax，0.5 ml lutlutamax（和0.1mMβ-苯甲醇。然后将N2/B27培养基补充3 µM GSK3抑制剂CHIR99021以诱导分化（第0天）。在下游实验的分化日至3日收集细胞，这在3天的分化期间显示了TBXT基因表达波动的一致结果。

　　CRISPR实验的所有指南RNA均使用UCSC基因组浏览器中的CRIRPOR算法进行设计。通过用Blasticidin-耐药基因代替纯霉素耐药基因，将引导RNA克隆到PX459V2.0-HYPACAS9质粒（addgene，质粒62988）或自定义衍生物中。本研究中的指南RNA成对设计以删除中间序列。与人类TBXT基因结构相比，通过指南RNA质量和相对距离选择了小鼠TBXT（TBXTINSASASASASASASASASAIS）中Alusx1和Aluy对的插入位点。RCS元素（TBXTINSRC）的插入位点与插入Aluy元素相同。补充表2列出了CRISPR靶向位点和指南RNA序列。

　　通过集成的DNA技术（IDT）合成所有寡核苷酸（加上金栅组件的悬垂），并使用BBSI限制酶（NEB，R3539）结合了空的PX459V2.0矢量。使用ZR质粒微型纯化试剂盒（Zymo Research，d4015）从3 ml大肠杆菌培养物中纯化构造的质粒。使用Puerelink Hipure Hipure质粒MIDIPREP试剂盒（Invitrogen，K210005）从250 mL大肠杆菌培养物中纯化用于ES细胞的质粒。为了通过核能促进DNA递送到ES细胞，将纯化的质粒在Tris-EDTA缓冲液（pH 7.5）中分离为无菌罩中至少1 µg µl-1的浓度。

　　使用核对器2B设备（Lonza，BioAAB-1001）进行DNA递送到人或小鼠ES细胞中以进行CRISPR-CAS9靶向。人类干细胞核对象试剂盒1（VPH-5012）和小鼠ES细胞核对象试剂盒（Lonza，VVPH-1001）分别用于将DNA输送到人和小鼠ES细胞中。ES细胞在核反理实验前一天进行双喂养，以保持较高的条件。

　　在对人ES细胞进行核反面之前，将6厘米的组织培养板用0.5 µg cm – cm-2 rmlaminin-521在37°C和5％CO2培养箱中至少处理2小时。Rlaminin-521处理的板可在将人ES细胞作为单个细胞播种时提供最佳的活力。将培养的人ES细胞用DPB洗涤，并使用Tryple选择酶（无苯酚红； Gibco，12563011）分离为单个细胞。根据制造商对核对器2B设备的说明，使用程序A-023进行了100万人ES细胞单细胞。将转染的细胞转移到Rlaminin-521处理的6厘米板上，并具有补充1×Revitacell但不含青霉素 - 链霉菌素的预热的Stemflex完整培养基。核霉素后24小时进行抗生素选择（最终浓度为0.8μgml– 1; Gibco，A1113802）。

　　使用StemPro Accutase（Gibco，A1110501）将小鼠ES细胞分解为单个细胞，并根据制造商的说明使用程序A-023转染了500万个细胞。使用在无馈物条件下培养的细胞进行小鼠ES细胞中的外显子缺失。将核定细胞铺在0.1％明胶治疗的10-CM板上，然后在用蓝乳苷后24小时选择抗生素选择（最终浓度为7.5 µg ML – 1； Gibco，A1113903）。使用依赖进料器依赖性条件培养的小鼠ES细胞进行了Alusx1-aluy对和InsRCS工程的插入。将小鼠ES细胞铺在播种在0.1％明胶治疗的10-CM板上的MEF细胞的单层上，然后在核能后24小时选择抗生素选择。

　　与PX459V2.0-HYPACAS9-GRNA质粒一起进行核反射，将单链DNA DNA寡核苷酸共延伸，以进行微学诱导的靶向序列缺失56。这些ssDNA序列是通过IDT通过其超级DNA寡核能服务合成的，其中包括两端的三种磷酸座键修饰。这些长ssDNA寡核苷酸的详细序列信息在补充表3中列出。

　　对于TBXTINSASAY和TBXTINSRC工程，基于同源的修复模板质粒，包括选择标记基因基因PURO-ΔTK（用于阳性选择的嘌呤霉素耐药基因和ΔTK，ΔTK，ΔTk，the herpes Simples Simperx病毒1型胸腺素激酶的截断版本，用于胸腺素激酶，用于否定的typerded consection ins at septed Data ins the Septed Data，wasted Data），图7）PX459V2.0-HYPACAS9-GRNA质粒。在核反理和抗生素选择后（从核控制第二天开始，持续3天），选择单个克隆，然后选择CRISPR-CASPR – CASPR – CASPR – CASPR – CASPR-CAS9-TARGETED基因座的PCR基因分型（外显子6删除（外显子）删除，插入Aluy，插入Aluy，插入Alusx1或插入rcs rcs）。补充表4列出了基因分型PCR引物。

　　使用Capture-Seq（见下文）进一步验证了PCR基因分型确认的克隆，以确认基因型并排除质粒DNA的任何随机整合的可能性。随后，瞬时引入了CRE重组酶以去除选择标记物puro-Δtk。将细胞用250 nm ganciclovir处理，以反理解ΔTK阴性细胞作为选择标记基因缺乏的细胞。在分离出TBXTINSASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASASRCS ES细胞的单小鼠ES细胞克隆之后，这些克隆被用于下游实验，包括体外分化测定和胚泡注射以生成小鼠模型。

　　如前所述39进行了捕获序列或目标基因座的靶向测序。从概念上讲，Capture-Seq使用自定义的生物素化探针从标准的全基因组测序库中的基因组基因座下拉序列，从而在更高的深度中对特定的基因组基因座进行测序，同时降低成本。

　　根据制造商的协议，使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus试剂盒（D4068）从小鼠ES细胞或感兴趣的小鼠的耳孔中纯化基因组DNA。按照标准方案制备了兼容Illumina测序仪的DNA测序文库。简而言之，使用Covaris LE220（450 W，10％占名因子，每次爆发的200个周期和90-S处理时间）将1 µg的GDNA剪切至500-900碱基对，然后用DNA清洁和浓缩物-5吉特（Zymo-git Research，Zymo Research，d4013）纯化。然后将剪切和纯化的DNA用末端修复酶混合（T4 DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶，NEB，M0203，M0210和M0201）以及使用Klenow 3'-5'-5'-'exo-enbeme（Nebe）（Nebe）（Neb）（Neb）（分别为a）（分别为T4多核苷酸激酶）（分别为NEB，M0203，M0210和M0201）。随后将Illumina测序库适配器连接到DNA末端，然后用KAPA 2X HI-FI HOTSTART READYMIX（Roche，KR0370）进行PCR扩增。

　　定制的生物素化探针通过使用BAC DNA和/或质粒作为模板作为诱饵制备作为诱饵。准备探针可以全面覆盖整个基因座。我们使用了从BACPAC基因组学购买的BAC线RP24-88H3和RP23-159G7来生成覆盖小鼠TBXT基因座的诱饵探针，​​以及上游和下游区域中约200 kb的侧翼序列。将汇总的全基因组测序文库与溶液中的生物素化诱饵杂交，并使用链霉亲和素涂层的磁珠纯化。下拉后，使用DSDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Q32851），使用Qubit 3.0荧光计（Invitrogen，Q33216）对DNA测序库进行定量。随后在配对端模式下在Illumina NextSeq 500 Suequencer上对测序库进行了测序。

　　使用Illumina Bcl2Fastq（V.2.20）对测序结果进行了反复，需要与索引BC序列完美匹配。使用Trimmomatic（V.0.39）修剪低质量的读数或碱基和Illumina适配器序列。然后使用BWA（V.0.7.17）将读数映射到小鼠基因组（MM10）。通过在UCSC基因组浏览器的镜像版本中可视化检查了TBXT基因座内外的覆盖范围和突变。

　　所有小鼠实验均按照NYULH的动物方案指南进行，并在NYU Langone Health啮齿动物基因工程实验室进行。在12小时的光线至12小时的黑暗周期中，将小鼠安置在NYU Langone Health BSL1屏障设施中，并具有环境温度和湿度条件。所有实验程序均由NYU Langone Health的机构动物护理和使用委员会批准。从杰克逊实验室获得野生型C57BL/6J（应变000664）小鼠。

　　TBXTΔEXON6/+杂合小鼠模型是通过将CRISPR试剂的Zygotic显微注射到野生型C57BL/6J zygotes（Jackson Laboratory Laboratory菌株000664）中生成的，从而适应了先前发表的协议57。简而言之，将CAS9 mRNA（Milliporesigma，cas9mRNA），合成引导RNA和单链DNA寡核苷酸共同注射到1细胞阶段的Zygotes中，按照上述程序57。从Synthego订购了合成指南RNA，作为其自定义的Crisprevolution Sgrna EZ试剂盒，其靶向位点与小鼠ES细胞的CRISPR缺失实验（auuucgggggucucugcagagaccgg and Caagaguaugcuggugaugaaccag）相同。共共注射的单链DNA寡核苷酸与上述相同。然后将注射的胚胎体外培养至胚胎阶段，然后胚胎转移到假寄养母亲中。二吻合微注射和转移后，根据异常尾部表型筛选创始人幼崽。大约在第21天，通过耳拳收集DNA样品，以进行PCR基因分型和捕获seq验证，以排除TBXT基因座的非目标。

　　确认基因型后，将TBXTΔEXON6/+创建者小鼠与野生型C57B/6J小鼠回染，用于产生杂合F1小鼠。由于各种尾巴表型，在两类中进行了F1杂合子之间的间交叉：1型间交叉包括至少一个没有尾巴或短尾巴的父母，而2型2类间交叉在两个长尾尾的F1杂合子之间交配（表1）。如表1所述，两种类型的间交叉在F2TBXTΔEXON6/+小鼠中产生了异质的尾巴表型，从而确认了尾部表型的不完整渗透率和缺乏纯合子（TBXTΔEXON6/ΔEXON6）。使用Bruker Xtreme Xtreme Ivis成像系统对成年小鼠（> 12周）进行麻醉以进行椎骨成像。为了确认纯合子中的胚胎表型，使用标准方案从定时的怀孕小鼠的E11.5妊娠期解剖胚胎。

　　将工程设计的TBXTINSASAYSAY和TBXTINSRCS小鼠ES细胞注入C57BL/6J-Albino（Charles River Laboratories，493菌株）的嵌合体F0创始人小鼠或注入B6D2F1/J（A F1 Hybrid prinitation c57BL/6J j JAWLILAP SEAKSON）的B6D2F1/J（纯合子F0创始人小鼠产生的胚泡。四倍体互补策略旨在与F0 Generation58中提出的基因型产生纯合小鼠。通过使用两种小鼠ES细胞系的多次注射试验，我们仅获得了一个TBXTINSASASASASASASASASASASASASASASASASAIS/INSASAY F0创始人小鼠（雄性），但对于TBXTINSRCS小鼠而没有。However, during genotype screening for TbxtΔexon6/+ founder mice, we serendipitously identified a male grey mouse that incorporated a heterozygous insertion in intron 5. Genotype analysis revealed that the insertion was a 220 bp DNA sequence from intron 6 of Tbxt (chromosome 17: 8439335–8439554, mm10), inserted in a reverse在设计的CRISPR靶向地点（染色体17：8438386，MM10）中，内含子5的互补场景。The inserted sequence insRCS2 in intron 5 therefore forms a 220 bp inverted complementary sequence pair with its original sequence in intron 6 (chromosome 17: 8439335–8439554, mm10), resembling the designed TbxtinsRCS and TbxtinsASAY gene structures.因此，该基因型称为TBXTINSRCS2。该TBXTINSRCS2/+小鼠的捕获-Seq基因分型证实，TBXTINSRCS2等位基因在C57BL/6背景中，而TBXTINSRCS2/+ FOUNTER的野生型TBXT轨迹来自DBA/2J JJ。因此，将此TBXTINSRCS2/+小鼠反向将C57BL/6野生型小鼠反射，并在F2生成中进一步间隔在F1杂合子之间产生纯合子（TBXTINSRCS2/INSRCS2）。TBXTINSRCS2/INSRCS2小鼠的捕获-Seq分析在TBXT基因座上证实了其C57BL/6背景（扩展数据图8）。我们还比较了年龄匹配的C57BL/6和DBA/2J小鼠中的尾巴表型，发现没有差异（数据未显示），这表明两种菌株之间的任何遗传背景差异都不会影响尾部长度。因此，使用TBXTINSRCS2小鼠（杂合子和纯合子）用于分析尾部表型。

　　TBXTINSASASASAIS和TBXTINSRCS2创始人小鼠分别回到野生型C57B/6J小鼠中，以产生杂合F1幼崽，然后在F1杂合子之间进行间断，以产生F2 Generation f2 Generation。在所有可用的基因型的情况下，小鼠的尾巴长度是在基因型和性别组中每月测量的。此外，在TBXTΔEXON6/+小鼠的不同基中，进行了两种类型的面包夹，TBXTINSRCS2/+ x TBXTINSRCS2/+tbxtΔexon6/+和TBXTINSRCS2/INSRCS2/INSRRCS2×TBXTΔEXON6/+，以分析其副词的尾巴现场。这些结果总结并在表2中列出。

　　为了分析胚胎尾部区域中鼠标TBXT的同工型表达模式，野生型，杂合子和纯合子胚胎（来自杂交实验）（tbxtinsrcs2/+×tbxtinSrcs2/+，tbxtinsrcs2/+，tbxtinsrcs2/+，tbxtsinsAsay/tbxtinSasay/+×tbxtinsasasasanasasasanasasay/+ gest at e e e e ection。收集了每个胚胎的尾梁以分离总RNA，并与胚胎组织一起用于GDNA，用于基因分型。这些结果如图4E所示。

　　使用基于标准柱的纯化试剂盒（Qiagen rneasy套件，74004），从人和小鼠ES细胞的未分化和分化细胞以及胚胎尾bud样品中收集总RNA。在RNA提取期间，采用DNase处理以去除任何潜在的DNA污染。提取后，通过基于核糖体RNA完整性的电泳评估RNA质量。使用1 µg的每个样品和一个高容量的RNA至CDNA试剂盒进行逆转录（Applied Biosystems，4387406）。补充表1列出了用于RT – PCR和/或定量RT -PCR的DNA寡核苷酸。

　　从野生型，tbxtinsasay/insasay，tbxtΔexon6/+和tbxtΔexon6/Δexon6基因型中，从第1天的体外分化小鼠ES细胞系中分离出的总RNA样品用于散装RNA测序分析。使用基于标准柱的纯化试剂盒（Qiagen rneasy套件，74004）制备RNA样品。为每个小鼠ES细胞基因型制备了两种生物学重复，其中两个TBXTΔEXON6/ΔEXON6小鼠ES ES细胞样品来自不同的克隆。使用NEBNEXT poly（a）mRNA磁性隔离模块（NEB，E7490L），使用NEBNEXT Ulta II定向RNA文库预备试剂盒（NEB，E7765L）制备RNA测序文库。

　　将原始测序读数映射到用星（V.2.7.2a）Aligner59的小鼠基因组（MM10）。将所有样品的特定于链特异性读数集成到矩阵中以进行下游分析。使用DESEQ2（V.1.40.2）60检测到差异表达的基因，使用其默认的两侧WALD检验，其中log2（折叠表达式更改）> 0.5> 0.5和多个测试调整的P值<0.05。来自所有样品中DESEQ2的前500个可变基因均使用主成分分析。TBXT靶基因是从先前的Publication41获得的，该靶基因由在体外分化的小鼠ES细胞中检测到的显着TBXT芯片–Seq峰信号定义。与野生型对照相比，在每个突变样品样品中鉴定出的显着差异表达基因的TBXT靶基因集与这些基因相交，并且这些基因在分析的小鼠ES细胞系中汇总以产生差异表达的TBXT靶基因的整体集。这些差异表达的TBXT靶基因使用热图可视化，并具有log10转化的归一化转录矩阵，然后在样品之间进行Z分数标准化。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。