WT C57BL/6J和B6.C（CG）-CD79ATM1（CRE）RETH/EHOBJ（CD79ACRE/+，也称为MB1-CRE49）小鼠是从杰克逊实验室获得的。S1PR2-CREERT2 BAC-TRANSGENIC MICE25是T. Kurosaki和T. Okada的礼物。Igktag小鼠是在洛克菲勒大学生成的。我们设计了图1A和扩展数据图1中所示的等位基因，带有标志标签（Dykddddk）和strep-II标签（WSHPQFEK），该标签（WSHPQFEK）由终止密码子和SV40 Poly-A转录终结器分开。The 522-nucleotide single-stranded DNA template (including 5′ and 3′ homology arms, each 100 nucleotides long) and the CRISPR guide-RNA (GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC) were purchased from IDT and prepared according to the Easi-CRISPR gene targeting method50 by the Rockefeller University Gene Targeting Resource Center and injected into zygotes obtained from C57BL/6洛克菲勒大学转基因服务核心设施的小鼠。我们验证了使用位于同源臂外部的基因组引物在整个基因座中正确插入等位基因。为了降低潜在的CRISPR脱靶效应的风险，在实验中使用之前，将一只创始人的小鼠至少在C57BL/6J小鼠上进行了反向跨至C57BL/6J小鼠。为了产生Igkflag/链球菌小鼠，将偶尔在CD79ACE/+ IGKTAG育种中偶尔自发生殖线重组获得的种系（表现出链球菌+ B细胞表面染色的Cre-Crengation小鼠）交叉到良好的Igktag菌株中。所有小鼠均在洛克菲勒大学的免疫科清洁设施下，在没有特定的病原体条件下。所有老鼠程序均由洛克菲勒大学的机构动物护理和使用委员会批准。
用10 µg TNP17 -KLH（BioSearch，T -5060）诱导了一小鼠（男性和女性，年龄为7-12周）在小鼠（男性和女性，年龄为7-12周）中诱导免疫反应，并补充了1/3卷的Imptoy Alum（Thermo Fisher Scientific）或I.P.用50 µg TNP-KLH免疫，用1/3体积的明矾或氢氧化铝凝胶（Alhydrogel，Invivogen）制备；20 µg重组产生的三聚体稳定的HA（见下文）在Alhydrogel中；用3 µg WH1（参考文献51）或BA.1尖峰mRNA包裹在脂质纳米颗粒（mRNA -LNP）中的肌肉内免疫，如下所述；或通过在胚胎鸡蛋中产生的小鼠适应于小鼠适应的PR8流感病毒（约33个斑块形成单位，由M. Carroll提供）。在S1PR2-IgkTAG小鼠中，在第4天，在第4天，第4天，在第4天和12天，在第4天和12天，在第12天和12天，在第12天的第12天和12天，在第12天的第12天和第12天，在第12天的第12天和第12天，在50 mg ml-1和8天，在50 mg ml-1的玉米油中溶于玉米油中的200 µl他莫昔芬（Sigma-Aldrich）的主要免疫反应映射。感染实验（图3）。在TNP召回实验（图2C）中，在指定的时间点上进行了与初级免疫相同的提升。对于同源mRNA -LNP实验（图2E），以与启动相同的方式进行增强，除了对于某些小鼠而言，左股四头肌的肌肉被增强（相反，在扩展数据中分层图3E）。对于异源mRNA -LNP召回实验（图4），在所有情况下，增强都是对侧的。对于HA免疫实验（图3），同侧进行了同源或异源HA蛋白促进，完全作为初级免疫。对于感染实验，如先前所述，用5 µg HAPR8或用1/3体积的Alhydrogel制备的脚垫在3个月后通过皮下免疫来增强小鼠，如前所述21。在所有情况下， 额外的增强免疫接种与第一个提升相同。通过脸颊穿刺收集血液样本，用凝血活化剂血清凝胶制备的微管（Sarstedt，41.1378.005）。
如Previously21所述，重组已用于免疫，并使用CHO细胞蛋白表达系统在内部生产ELISA。半胱氨酸残基被引入HA序列中，以创建稳定的二硫键键，如最初针对H1/A/A/California/07/2009所述（参考文献52）。我们描述了HAPR8和HACA09 PEOT21的产生。对于HAFM1和HANC99，遵循了相同的程序，包括引入固化突变。为了进行免疫接种，通过凝血酶裂解除去了非本地HA（FOLDON，AVI-TAG，HIS-TAG）的C末端结构域，并随后是快速蛋白质液相色谱法（FPLC），然后在存储磷酸盐缓冲液（PBS）之前被固定。对于ELISA，使用未治疗的FPLC纯化蛋白。从CGG免疫的小鼠（克隆2.1（参考文献53））获得的高亲和力特异性单克隆抗体被修饰，以用作FLAG/StREP ELISA检测的标准。Heavy and light chain constant regions in the original human monoclonal antibody plasmids54 were replaced with the mouse IgG1 and Igκ constant regions and the C terminus of Cκ was modified to encode a LoxP site and a Ser-Gly-Gly linker followed by either a Flag or Strep-tag, yielding Cκ chains that were identical to those produced by IgkTag mice before and after recombination, respectively.将mAb-flag或mab-strep轻链质粒与重链质粒一起转染到HEK293F细胞（Thermo Fisher Scientific，R79007）中，并使用蛋白-G亲和色谱法纯化，如前所述53。细胞系对支原体的阴性测试，除了测试其产生的蛋白质外，未被认证。为了比较Flag+和strep+抗TNP抗体滴度之间的亲和力成熟（图1H），在内部制造了自定义的低和高荷马牛血清白蛋白（BSA）结合。BSA（在PBS中；在2.5 mg ML-1的Thero Fisher Scientific，77110）与TNP-ε-aminocaproyl-Osu孵育 （BioSearch Technologies，T-1030）在PBS中，在旋转时在室温下以1：2或1:20的摩尔比为20％的二甲基亚氧化二甲基亚氧化物。通过PBS中的透析去除未结合的TNP-ε-氨基苯基osu。最终TNP：通过测量280和348 nm的吸光度，BSA结合率估计为〜1：1和〜1：13，这些试剂称为TNP1-BSA和TNP13-BSA。通过确定在280 nm处的TNP-ε-氨基苯基osu的灭绝系数来校正BSA浓度。除图1H外，所有其他TNP ELISA都使用了商业TNP4-BSA（BioSearch Technologies，T-5050）（如下所述）。
WH1 s mRNA疫苗是根据SARS-COV-2 S蛋白序列（Wuhan-Hu-1，Genbank：MN908947.3）设计的，其中赖氨酸和缬氨酸氨基酸处于986–987位的位置，以修饰以填充预溶剂以获取预先刺激的mrna-mrna-mrna-incodemed mrna-incodeced ragun-incodeced。通过引入BA.1特异性修饰，从WH1 s获得了BA.1 s氨基酸序列。如前所述55，将WH1和BA.1 s的编码序列被密码子优化，合成并克隆到mRNA产生质粒（Genscript）中。如前所述55进行mRNA的产生和LNP封装。简而言之，将mRNA转录为包含101个核苷酸长的聚（A）尾巴。M1ψ-5'-三磷酸（Trilink）而不是UTP用于产生含核苷的修饰mRNA。使用三核苷酸CAP1类似物（Trilink）共同转录进行体外转录的mRNA上限。如前所述56，通过纤维素（Sigma-Aldrich）纯化纯化mRNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析所有mRNA，并在-20°C冷冻。如前所述，使用自组装过程将含纤维素纯化的M1ψ的RNA包裹在LNP中，从而将可电离阳离子脂质的乙醇脂质混合物，磷脂酰胆碱，胆固醇和聚乙烯乙二醇 - 脂质迅速与含有含有含有含氧酸的mrna的酸性mrna ph57混合在一起的乙醇脂质混合物。在2017/004143的专利应用中描述了可电离的阳离子脂质和LNP组成。表征了RNA负载的颗粒，然后以1μgμl-1的浓度在-80°C下存储在-80°C下。这些mRNA -LNP的平均流体动力直径约为80 nm，多分散指数为0.02-0.06，封装效率约为95％。
为了对周围B细胞进行流式细胞术分析，用乙二胺二乙酸乙酸（EDTA）在微管中收集血液，以防止凝血并用铵 - 氯化铵 - 氯化铵（ACK）缓冲液（LONZA）治疗以凝固红细胞。对于淋巴结样品，通过与一次性微型植物（Axygen）机械拆卸获得细胞悬浮液。通过通过70μm细胞滤网过滤并用ACK缓冲液进行脾脏匀浆。通过在10,000g的刺穿胫骨和股骨下离心10 s，然后用ACK缓冲液处理骨髓细胞。将来自每个组织的细胞重悬于补充有0.5％BSA和1 mM EDTA的PBS中，并首先与FC-Block（大鼠抗小鼠CD16/32，2.4G2，Bio X细胞）在冰上孵育30分钟，然后在30分钟内用各种荧光量（补充表1）与各种荧光量（补充表1）一起孵育30分钟。在对BD FACS交响乐仪进行分析之前，将细胞过滤并用相同的缓冲液洗涤。使用FlowJo（V.10）分析数据。
为了确定IGKTAG小鼠中表位标记的抗体的存在，稳态成年小鼠的血清样品和精度以及双色蛋白标准标准（Bio-Rad）在SDS-PAGE Mini-PROTEAN TGX蛋白质凝胶（Bio-Rad）上以淡淡的浓汤和浓重的抗体抗体替补剂切成症。使用IBLOT凝胶转移系统（Invitrogen）将样品转移到聚偏二氟乙烯膜中。将膜在室温下在室温下堵塞2小时，同时在20-20之间的PBS（0.05％）中轻轻摇动，然后在同一缓冲液中与1：2,000抗flag-hrp（D6W5B，D6W5B，细胞信号技术，86861s）或抗链球pag-trep-trep-trepmab-clapmab-cla，bio bio bio bio bio bio bio bio bio bio bio bio，山羊抗小鼠IGκ-HRP（Southern Biotech，1050-05）。在使用Azure C300凝胶成像仪（Azure Biosystems）的化学发光检测前，用PBS-Tweet-20对膜进行广泛洗涤，并随后与Western印迹ECL底物（Amersham）一起孵育。
如前所述进行ELISA，并进行特定的修改，以进行直接的FLAG/链球链球链球菌比较。并排执行旗帜/链球菌ELISA，并在每个96孔板上使用内部标准标准进行。为了检测抗原特异性血清抗体滴度，将板在PBS中用抗原在4°C下涂层过夜（TNP4-BSA的10 µg ml-1，内部缀合的TNP1/13-bsa（见上方）和1 µg ml-ml-ml-ml-ml-ml-sars-for his和sars-cov-for hiss-cov-for his和sars-cov-for his和sars-cov-for his和sars-cov-for hiss-cov- 2 µg ml-140592-V08H，40592-V08H121，40589-V08H26; WH1 S和RBD蛋白是P. Wilson的礼物）。对于FLAG/链球菌标准曲线，将井涂有10 µg ml -1纯化的IGY（Gallus Immunotech）。用PBS-TWEON（PBS+0.05％Tween-20，Sigma-Aldrich）洗涤后，将板在室温下阻塞2小时，PBS为2.5％BSA。将血清样品在PBS中稀释1：100，并在三倍稀释液中连续滴定。小鼠抗Igy mab-flag或mab-strep也以三倍稀释液串制滴定（扩展数据图2D）。The samples were incubated for 2 h and then washed with PBS-Tween, before adding one of the following HRP-detection antibodies: goat anti-mouse IgG (Jackson Immunoresearch, 15-035-071), rat anti-mouse Igκ (Abcam, ab99632), goat anti-mouse IgM (Southern Biotech, 1020-05), rabbit抗flag-HRP（D6W5B）或小鼠抗突变（Strep-Tag II strepmab-classic）30-45分钟。定义了抗FLAG和抗抗抗体抗体的稀释液，以便通过滴定FLAG和链球菌标记的单克隆抗体产生的曲线等效（扩展数据图2D）。用PBS-TEEN洗涤后，将样品与3,3'，5,5'-四甲基苯甲酰苯底物（缓慢动力学形式，Sigma-Aldrich）一起孵育，并用1 N HCl停止反应。在Fisher Scientific Accuskan FC读板上，在450 nm处测量光密度（OD）吸光度。为了使旗帜和链球菌终点滴度归一化， 计算血清滴度稀释度，每个样品通过其各自的单克隆抗体的阈值OD值在20或6.67 ng µl -1的固定浓度下。滴度是通过稀释液的对数插值来计算的，在单克隆抗体OD上的读数上方的读数上方正上方和下方使用58。
对于总血清IgG ELISA，将板涂有抗小鼠IgG。使用未标记的小鼠IgG（Southern Biotech，0107-01）生成标准曲线，并使用抗小鼠IgG-HRP（Southern Biotech）进行检测。为了耗尽血清样品的IgM，根据制造商的说明，使用了抗小鼠IgM琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，A4540）。用PBS洗涤珠子，并以1:20样品的比例孵育样品，以旋转在4°C下过夜。通过离心3分钟以10,000g离心3分钟，并将未结合的上清液分数用于后续ELISA。为了确认IgM耗竭的效率，如上所述，用山羊抗小鼠IGM，未标记的IGM和抗小鼠IGM-HRP（Southern Biotech）测量了总IgM水平。
在SRNA-LNP免疫化的S1PR2-IGKTAG小鼠中收集的样品的FLAG+与链球菌+血清分数评估了病毒中和滴度。为了分开分数，根据制造商的说明，执行了用抗FLAG M2磁珠（Sigma-Aldrich，M8823-5ML）和MAGSTREP 3 X X X X X X X型珠（IBA，2-4090-010）的免疫沉淀。简而言之，将磁珠用样品缓冲液（用于旗珠的Tris缓冲盐水盐水和1×缓冲液W（IBA，2-1003-100）的Magstrep珠洗涤），并以20：1样品的比例将样品孵育，以在4°C的旋转下串珠，以使树脂在4°C下过夜。使用磁分离器分离珠子结合的部分并丢弃，同时收集未结合的分数。通过离心到输入浓度的一半和热灭活的一半，将分离的样品浓缩。使用SARS-COV-2峰值型伪型HIV-1基于HIV-1基于HIV-1的NanoLuc荧光素酶报告基因测定符于先前描述的基于SARS-COV-2峰值型HIV-1，对中和SARS-COV-2中和1 SARS-COV-2的程度进行了近似29。简而言之，将血清样品用最终的1:00血清的最终稀释液连续稀释五倍，并在37°C下与SARS-COV-2 WH1或BA.1 Spike Pseudotyped的HIV-1报告基因病毒一起孵育1小时，然后转移至HT1080/ACE2.CL14细胞59。在48 h时，洗涤细胞并裂解细胞，并使用纳米GLO荧光素酶测定系统（Promega）和Glomax导航器发光器（Promega）测量荧光素酶活性。使用在没有血清的情况下感染的细胞将相对发光单元标准化，然后绘制在GraphPad Prism中。使用扩展数据中显示的曲线的四参数非线性回归（最小二乘回归方法）计算NT50值。显示了两个技术重复的平均值，排除了离群值。对于NT50的比较，输入和分数（图4G和扩展数据图5C）， 调整了分离样品的NT50以均衡BA.1 RBD ELISA TITRE，与输入分数中相应的ELISA滴度相比，未耗尽的标签的rbd ELISA滴定。
在SARS-COV-2 OMICRON BA.1 SPIKE RBD的背景下设计了重复的单突变位点饱和变体库，并由Twist Bioscience生产，与以前对其他SARS-COV-2变体60,61进行了基本相同。The GenBank map of the plasmid encoding the unmutated Omicron BA.1 RBD in the yeast-display vector is available at GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron/blob/main/data/3294_pETcon-SARS2-RBD_Omicron-BA1.gb).通过Twist Bioscience将场地饱和变体库作为双链DNA片段传递，并进行条形码，并将其批量克隆到酵母 - 播放载体载体骨架中。将条形码的突变库质粒DNA电穿孔到大肠杆菌（Neb 10-beta电能细胞，新英格兰Biolabs，C3020K）中，并瓶颈为1×105 CFU（每个单个突变体的平均值> 25 borcodes）。纯化质粒DNA并转化为Awy101酵母菌菌株。16个核苷酸条形码与其BA.1通过PACBIO测序相关，并且基本上测量了RBD表达和ACE2结合的突变的效果，基本上如所述61。这些实验在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sars-cov-2-rbd_dms_omicron）上进行了描述和分析。
通过独立的突变体WH1或BA.1 RBD文库进行了生物学副本，在生物学副本中进行了降低血清中RBD结合的实验映射突变。1类似于单克隆抗体抗体62和人类多克隆等离子体样品的所述，如前所述。首先，每种血清中的75 µL通过在室温下在4°C下与37.5 OD的Awy101酵母单位在4°C下孵育2小时，两次被非特异性的酵母结合抗体脱落，如前所述63。WH1和BA.1突变体RBD酵母菌库61用含半乳糖的，低脱脱糖的合成培养基与casamino酸（SD-CAA，6.7 G L-1酵母氮基碱，5.0 G l-l-1 casamino -1 casamino casamino casamino casamino base，1.065 g-l-l-1 er酸和2％（w/v）的casamino casamino base（w/v）casamino casamino碱基， + v + v + v + v + v + v + v + v + v;然后在室温下轻轻搅拌在室温下洗涤并用稀释的血清洗涤1小时。独立执行了针对每种WH1或BA的小鼠血清的每种测试组合。1RBD突变库损失了链球菌或FLAG-TAG抗体的结合。对于每种血清，使用浸润稀释度，以便在样品中，由于血清抗体与RBD结合的血清抗体引起的荧光信号量大致相等（1：1,000用于绘制链球链球抗体与WH1库的映射； 1：200用于绘制链球链球链球链球抗体，用于将BA.1库的链球链球植物映射到BA.1库中； 1:50;然后将酵母库以1：100 FITC偶联的抗Myc抗体（免疫学顾问实验室，CYMC-45F）标记为1小时，以标记用于RBD的表达，而1：200 APC偶联链霉素链霉素（用于brateptrogens s-868）in Infeptrogen s-868）in bountep antep antep antep antep antip antip ant cont conties或Apc-Conj-conjies或（Biolegend，637308）标记有限标记的抗体。绘制流式细胞仪选择门，以捕获其RBD表达程度降低抗体结合的RBD突变体。对于每个样本， 在BD FACSARIA II细胞分类器上处理约4×106的细胞。如上所述，在SD-CAA中将血清排出的细胞生长过夜，如上述2％（w/v）葡萄糖，无半乳糖和100 U mL-1青霉素 + 100 µg ml-1链霉素，以在质粒提取之前膨胀细胞。
从30个OD单位（1.6×108个集菌群形成单元（CFU））中提取质粒DNA，并在前一夜之间培养了5个OD单位（约3.2×107 cfu），对血清中培养的细胞（zymoprepreprepreprepreprepreprepreprepreprepreprepreprep酵母菌质粒Miniprep ii），如前所述。如先前所述60,62所述，通过聚合酶链反应扩增了16个核苷酸条形码。在Illumina NextSeq 2000系统上对条形码进行了测序，并具有50 bp的单端读数。
基本上按照先前所述的62计算逃生部分。我们使用DMS_VARIANTS软件包（https://jbloomlab.github.io/dms_variants/，v.1.4.0）来计数每个预选和血清散布中的每个条形码RBD变体。对于每个选择，我们通过参考文献中提供的公式计算了每个条形码变体的逃生分数。62。这些逃逸部分表示表达落入逃生箱中的特定变体的细胞的估计比例，因此值为0表示该变体始终由血清结合，值为1表示它始终逃脱血清结合。然后，我们应用了一个计算过滤器以删除具有> 1个氨基酸突变的变体，低测序计数（<50 in the preselection condition) or highly deleterious mutations that might cause antibody escape simply by leading to poor expression of properly folded RBD on the yeast cell surface (an ACE2 binding score of <−2 or an RBD expression score of <−1.25 or <−0.83361 for the WH1 and BA.1 mutant libraries, respectively, reflecting the different baseline expression levels of the two wild-type RBDs). The reported antibody-escape scores throughout the paper are the average across duplicate libraries; these scores are also in Supplementary Table 1. Correlations in final single-mutant escape scores are shown in Extended Data Fig. 6c. Full documentation of the computational analysis is available at GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS).
The serum-escape map logo and line plots were created using the dmslogo package (https://jbloomlab.github.io/dmslogo, v.0.6.2). The height of each letter indicates the escape fraction for that amino-acid mutation. For each serum, the logo plots feature any site where for ≥1 library/antibody tag condition, the site-total antibody escape was >10×所有站点的中位数，至少10％是任何站点的最大值。对于每个样品，将Y轴缩放为（1）该样品观察到的最大站点逃生度量的最大值，或（2）20倍该等离子体的所有位点观察到的位点逃生分数。生成这些徽标图可视化的代码可在GitHub（https://github.com/jbloomlab/sars-cov-2-rbd_map_oas/blob/main/main/results/summary/summary/escape_profiles.md）上获得。为了可视化RBD结构上的血清逃脱，WH1 RBD表面（PDB：6M0J）在每个位置的站点逃生度量标准上进行了颜色，白色表示没有逃生，红色表示逃生最多的地点。
用于比较条件的统计测试在图传奇中指示。没有使用统计方法来确定样本量。使用GraphPad Prism v.9进行统计分析。使用FlowJo（V.10）进行流式细胞仪分析。使用Prism（V.9）绘制图形，并使用Adobe Illustrator CS进行编辑。对于对数尺度（例如血清抗体滴度）绘制的数据，对对数转换的数据进行了统计分析。反应率低于检测极限的样品分配了100值，因为最高稀释量为1：100。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。