Raji（CCL-86），K562（CCL-243），SKOV3（HTB-77）和293T（CRL-3216）的人类癌细胞系来自美国型培养物（ATCC）。在RPMI -1640培养基中培养Raji细胞，其中10％FBS，2 mM-谷氨酰胺（Invitrogen）和1％青霉素 - 链霉素（Invitrogen）。在补充10％FBS，1％青霉素 - 链霉素和2 mM-谷氨酰胺（Invitrogen）的DMEM培养基（Invitrogen）中培养SKOV3和293T细胞。UMRC3细胞系从Sigma -Aldrich（08090512）中获得，并在DMEM培养基中培养10％FBS，2 mM-谷氨酰胺（Invitrogen）和1％Penicillin-链霉素（Invitrogen）。乳腺癌的PDX细胞系BCX.010由MD Anderson Cancer Center（MDACC）的F. meric-Bernstam提供，PATC148细胞由A. Maitra（MDACC）提供。BCX.010和PATC148细胞均在补充的DMEM（Invitrogen）中培养10％FBS，1％青霉素 - 链霉素和2 mM-谷氨酰胺（Invitrogen）。每3-4天传递一次细胞。使用CRISPR – CAS9方法（下面详细介绍）删除UMRC3细胞中的CD70基因，以生成CD70 KO UMRC3细胞。将UMRC3和BCX.010细胞转导至表达GFP以进行荧光监测。Raji细胞被转导至表达MCHERRY或GFP，并将K562细胞转导至表达MCHERRY，以通过显微镜进行荧光监测。对拉吉细胞进行修饰以表达萤火虫荧光素酶，以使体内成像具有生物发光。所有细胞均在37°C的5％CO2中保持在5％CO2中，并通过在MDACC细胞系表征核心设施处通过str分析来验证。使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA）定期测试所有细胞系对支原体污染的测试，仅在对污染阴性测试时才使用。
MDACC CB银行根据机构审查委员会批准的协议（LAB04-0249）提供了绳索血液（CB）单位。通过密度梯度（Ficoll-Histopaque，Sigma）分离来自CB的淋巴细胞。按照制造商的说明，使用NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从淋巴细胞中纯化NK细胞（CD56+CD3–）。使用重组人（RH）IL-12（Biolegend; 10 ng ML – 1），RHIL-18（MBL International; 50 ng ML – 1）和RHIL-15（Biolegend; Biolegend; Biolegend; 50 ng ML – 1）在使用先前描述的2次（cytig pbs）上（Inly cytoke extriged）（50 ng ml – 1），使用cytig cy cytoke（50 ng ml – 1）将分离的NK细胞在16±2 h中进行16±2 h。馈线细胞与NK细胞比为2：1的细胞（UAPC），并在50％点击的培养基中培养（EHAA，Fujifilm）和50％RPMI-1640（以下称为NK细胞培养基），补充了Rhil-2（Proleukin，200 U ML – 1，Chiron）。每2-3天更改培养基，并每周将辐照的UAPC添加到NK细胞培养中以支持扩展。用逆转录病毒构建体的NK细胞转导（下文）是在UAPC扩展后第5-6天进行的。将来自每种条件的NK细胞相等数量，用于CRISPR – CAS9 KO，并在转导后的第2天扩展。除非另有说明，否则在第14-15天（第二次扩展后7-8天）进行功能实验。使用ViaStain AOPI染色溶液（Nexcelom）和Cellometer Auto 2000（Nexcelom）仪器定期记录细胞计数，以监测NK细胞增殖或在功能测定时确保条件之间相等的细胞数量。
CD70靶向汽车（CD27（ECD）.cd28.ζ.2A.IL-15）（称为CAR70 – IL-15）结合了与CD27的ECD（CD70配体的天然受体），与CD28共刺激域和CD3ζ信号域链接。它还包括IL15转基因。CAR70构建体是通过限制消化来删除IL-15来生成的。CAR70构建体中ITAM的六个酪氨酸（Y）残基更改为苯丙氨酸（F），称为CAR70.3ζ.Y6F44。删除了CAR70构建体的整个CD3ζ区域，并称为CD27（ECD）。
The construct for the TROP2-targeting CAR (TROP2scFv (clone hRS7).CD28.ζ.2 A.IL-15), referred to as CAR.TROP2–IL-15, consists of a scFv targeting TROP2 (derived from the sequence of the TROP2-targeting antibody–drug conjugate sacituzumab govitecan, human RS7 (hRS7))与CD28共刺激域和CD3ζ信号域相关。同样，构建体包括IL15转基因。
所有CAR构建体和编码IL-15的逆转录病毒构建体均由Geneart Gene Synthesis（Thermo Fisher Scientific）克隆到SFG逆转录病毒主链中，以产生病毒载体。瞬时逆转录病毒上清液是由带有CAR质粒的293T细胞以及包装和包膜质粒产生的。流式细胞仪转导后48-72小时测量CAR转导效率。
对于CAR刺激测定，将人CD27配体– CD70蛋白（Acrobiosystems，CDL-H82D7）放在适当的板中的PBS中（96孔ELISA板或6孔板），浓度为1.2μgml-g Ml – 1。将盘子放在板振杆上的4°C过夜。在刺激前，将来自指定条件的NK细胞置于NK细胞培养基中，没有任何细胞因子支持的NK细胞培养基。第二天，吸气PBS，在短暂离心步骤后，在37°C的板中刺激了来自指定条件的NK细胞，以促进NK细胞与表面涂层CD70的指示条件的均匀相互作用。然后根据下游测定法以适当的间隔收集NK细胞（PCREB检测30分钟，qPCR为24小时）。对于使用CD16，NKP30和NKP46的刺激测定，使用了以下抗体：抗人CD16（BD Biosciences，3G8，556617），抗人类NKP30（R＆D Systems（R＆D Systems，210845，MAB1849）和Anti-Human NKP46（EBICIERCE，EBICIERCE，9E），9E，9E。与CAR刺激测定相似，将抗体在适当的板中以1μgml– 1的浓度镀在适当的板中。然后按照所述的汽车刺激进行测定。
对于细胞因子刺激，将NK细胞置于NK细胞培养基中，而在刺激前24-72小时，没有任何细胞因子支持。第二天，通过连续稀释制备了含有各种细胞因子浓度（50 pg ml – 1，500 pg ml – 1和5,000 pg mL – 1）的NK细胞培养基。对NK细胞进行计数，沉淀，然后在相应的细胞因子浓度的培养基中以相等的数量重悬于相等的数量，并在适当的间隔内孵育（用于PCREB检测和PKA量热测定30分钟，QPCR 24小时）。使用了以下细胞因子：Rhil-2（proleukin），Rhil-10（Stemcell Technologies，78024.1），Rhil-12（p70，Biolegend，573004），Rhil-15（Biolegend，Biolegend，570304），Rhil-18（Rhil-18对于IL-15拮抗实验，使用功能级IL-15单克隆抗体（Ebioscience，16-0157-82，克隆CT2NU）以100 ng Ml – 1的浓度使用，其中指示中和可中和人类IL-15的生物活性。
收集NK细胞或肿瘤细胞进行流式细胞仪，用PBS洗涤，用活/死固定的水上死细胞染色（Thermofisher，1：200）染色并染色，以确定其生存能力。用FACS缓冲液洗涤后（含1-2％FBS的PBS）后，将细胞离心，并将沉淀重悬于抗体鸡尾酒中，在室温下在室温下进行混合并孵育20分钟，以防止光线染色进行表面染色。使用共轭山羊F（AB'）2抗人LGG（H+L; Jackson Immunoresearch）测量IL-15 NK细胞的转导效率，该抗性（如前所述）3。使用抗CD27抗体测量了用各种CD70靶向构建体转导的CAR-NK细胞上的CAR表达。通过在人trop2 – TacSTD2蛋白中孵育细胞，以1.2μgml– 1的浓度在室内温度下，用PBS洗涤，并用抗静脉静止温度，将CAR表达在人类Trop2-TacSTD2蛋白中孵育30分钟，以1.2μgml– 1的浓度孵育30分钟，以1.2μgml– 1的浓度孵育30分钟，以1.2μgml– 1的浓度进行测量。以下抗体用于流式细胞仪实验：APC-CY7抗人CD3（Biolegend，HIT3A，300318，1：100）;BV605抗人CD56（Biolegend，HCD56，318334，1：50）;BV650抗人CD16（BD Biosciences，3G8，563173，1：50）;PERCP抗人CD45（Biolegend，Hi30，304026，1：50）;APC-CY7抗人CD45（Biolegend，Hi30，304014，1：50）;PE-CF594抗人CD27（BD Biosciences，M-T271，562297，1：50）;PE-CY7抗人CD70（Biolegend，113-16，355112，1：50）;AF-700抗小鼠CD45（Biolegend，QA17A26，157616，1：50）;PE Anti-Human Trop2（Biolegend，NY18，363804，1：50）;抗HIS-APC（Biolegend，J095G46，362605，1：50）;PE抗人CD326（Epcam; Biolegend，9C4，324206，1：50）;抗人CD215（IL-15Rα； BD Biosciences，JM7A4，566589，1：40）;和Anti-KI67（BD Biosciences，B56，563462，1：33）。Ki67的染色需要如下所述的其他固定和透化步骤。使用LSRFortessa（BD Biosciences）获取数据，并使用FlowJo软件（V.10.8.2）进行分析。所有排序均在BD生物科学ARIA II细胞分系台或MDACC北部校园流式细胞仪和细胞成像核心设施的Beckman Coulter Cytoflex SRT细胞分系台上进行。NK细胞的代表性门控策略如图1所示。
通过在Brefeldin A（10μgml– 1，BD Biosciences Golgiplug，555029）和Monensin（1 x，Biolegend，Biolegend，420701）的情况下，以E/T的比率为1：1，为5-6小时，通过E/T比为1：1的NK细胞以1：1为1：1，为5-6小时。未刺激的NK细胞用作阴性对照，用佛波尔12-羟基苯二酸盐（Sigma-Aldrich，p8139）刺激的NK细胞和Inomycin（Sigma-Aldrich，I0634）用作阳性对照。孵育后收集细胞，用PBS洗涤，并使用可活/死的固定水上死细胞染色试剂盒（Thermofisher，1：200）染色，以鉴定可行的细胞。然后将细胞用表面抗体在黑暗中的室温下染色20分钟。然后根据制造商的说明，使用BD细胞膜/细胞处理试剂盒（BD Biosciences，554714）固定细胞并通透细胞。用PE抗人IFNγ（Biolegend，506507，1：40）和PE-CY7抗人类TNF（Biolegend，502930，1:40）抗体在4°C下进行30分钟。通过流式细胞仪评估IFNγ和TNF的表达，并表示为CD56+CD3 -NK细胞的百分比。
FOXP3转录因子染色试剂盒（EBIOSCIENCE）用于PCREB和CREM染色。简而言之，如上所述，用PBS洗涤细胞（剥夺了细胞因子载体24小时），并用活/死固定的水上死细胞染色（Thermofisher，1：200）染色。洗涤后，将细胞重悬于NK细胞培养基中，并在带有IL-15的96孔板中刺激细胞，或在上述在37°C的抗原涂层板上刺激30分钟。在刺激步骤之后，将细胞固定并用FOXP3固定/PERS缓冲液在4°C的板振动板上渗透45分钟。然后用1×perm洗涤缓冲液洗涤细胞两次，然后用PE抗人类PCREB（PS133）/PATF-1（PS63）抗体（BD Phosflow，J151-21，558436，1:20）染色，或者抗人类CREM（Santa Cruz Biotechnology，22，SC11530，pepending and pertention and Scipie and Pertenting and pertention and Scipie and pepending and pertention and pepenties and pepenting and pertention and Scipies and pepending and pertecties and perterlangies and perseper，实验，在室温下持续30分钟。然后将细胞洗涤两次，并在流式细胞仪上获取数据。用FSK（Sigma-Aldrich，F6886）以20μM浓度处理的细胞用作阳性对照。在某些实验中，将细胞用PKA抑制剂H89，二氢氯化物（细胞信号，9844）以30μM的浓度处理刺激前1-2小时。对于钙螯合，编制了500毫米EGTA的储备溶液如下：6.645 g 10 N NaOH，EGTA（Millipore，324626）和Milliq DH2O至100 mL。在刺激前用10 mM EGTA处理相应条件下的细胞1-2小时。
使用IP裂解缓冲液（Pierce IP裂解缓冲液，Thermo Scientific，87788）裂解所示的NK细胞，并补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂单使用鸡尾酒，EDTA，Thermo Scientific，Thermo Scientific，78443），并为30分钟On Ice Ice unubed。离心后获得全细胞裂解物。BCA蛋白测定试剂盒（Pierce）用于测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE将来自指定条件的细胞裂解物以相等量进行电泳，并转移到聚乙烯二氟化物膜（Bio-Rad）中。用5％牛奶（在PBST）或5％BSA（在PBST中）封闭膜，持续30分钟，然后在4°C下孵育过夜。使用了以下主要抗体：PCD3ζTyr142（ABCAM，EP265（2）Y，AB68235，1：1,000）;CD247/CD3ζ（Bethyl Laboratories，A305-212A，1：2,000）;CREM（Creative Diagnostics，Cabt-B10032，1：2,000）;PCREB（SER133；细胞信号，87G3，9198，1：1,000）;总CREB（细胞信号，48H2，9197，1：1,000）;STAT3（Cell Signaling，9139，1：1,000）;PSTAT3（细胞信号，9145，1：1,000）;STAT5A（细胞信号，4807，1：1,000）;STAT5B（细胞信号，3466，1：1,000）;PSTAT5A/B（EMD Millipore，04-886，1：1,000）;STAT5-PY694（细胞信号，4322s，1：1,000）;STAT5（细胞信号技术，94205s，1：1,000）;JAK1-PY1034/1035（细胞信号，74129s，1：1,000）;JAK1（细胞信号，3344s，1：1,000）;JAK2-PY1008（细胞信号，8082s，1：500）;JAK2（细胞信号，3230s，1：1,000）;S6-PS240/244（细胞信号，5364s，1：1,000）;S6（细胞信号，2217S，1：1,000）;SOCS1（细胞信号，55313s，1：1,000）;和β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，AC-15，A5441，1：5,000）。将膜用PBST洗涤3次（每个5分钟），然后与继发抗体（驴抗兔IgG，HRP链接的整个AB，Genesee Scientific，84-854，84-854，Sheep抗小鼠IgG和HRP抗小鼠IgG，HRP-hrp-n-hth hot and and and and and and and and and and and and genesee scientific of Scientific，84-84-84-84-84-848； 60分钟。在适用的情况下，将膜被剥离以消除结合的抗体，并使用蛋白质印迹剥离缓冲液（Thermo Scientific）进行进一步的蛋白质分析。按照制造商的说明，使用ECL（Amersham）检测蛋白质信号。通过评估指示蛋白的带强度平均灰度值，并使用相应车道的总蛋白的平均灰度或加载对照（β-肌动蛋白）使用ImageJ 1.53T软件来进行光密度分析。
用相应的IL-15浓度在37°C下刺激了缺乏细胞因子24小时的NK细胞24小时。然后按以上制备细胞裂解物。按照制造商的说明，使用PKA比色活性试剂盒（Invitrogen，EIAPKA）测量PKA活性。
对于CRISPR – CAS9介导的KO，从综合DNA Technologies（IDT）获得了预设计的SGRNA靶向CREM，ICER，CD70，STAT3，STAT3，STAT3，STAT5A和STAT5B。所使用的GRNA序列如下所示。
对于CREM特异性外显子KO（扩展数据图3a，d，e）：sgrna-1：accacctagtattgctacca;SGRNA-2：TCTTCAATCTTGGGAACACC。
对于ICER特异性外显子KO（包括ICER特异性外显子1和外显子2（扩展数据图3A，D，E））：SGRNA-1：GCTGTAACTGGAGAGATGACAC;sgrna-2：gctcgatcttaccactaagc。
对于CD70：SGRNA-1：TCACCAAGCCCGCGCGACCAAT；SGRNA-2：GGCCATCTGCTCCTCCACGA。
对于STAT3：SGRNA-1：GCAGAAACTCTCACGGACG；sgrna-2：tcttctgcctggtcactgac。
用于Stat5a：Sgrna-1：caagtagtgccggacctcga;SGRNA-2：cattgacttggacaatcccc。
对于STAT5B：SGRNA-1：CATCAGATGCAAGCGTTATA；SGRNA-2：AAATAATGCCGCACCTCAAT。
为了形成核糖核蛋白（RNP）复合物，将SGRNA（100 µM）与Cas9（Alt-R S.P. Cas9核酸酶V3，1081059）结合使用P3主要溶液（p3主要细胞4D-核F-核型X KIT S，LONZA），在SGRNA至p3至P3-p3至Cas9 Repio的0.22：0.22：0.22：0.22：0.22：0.22：0.22：0.22：0.48。将RNP复合物在室温下孵育20分钟。收集100万个NK细胞，用PBS洗涤两次，在有电穿孔增强剂（IDT，ALT-R CAS9电穿孔增强剂，1075916）和P3主要溶液中，在20 µL RNP复合物中重悬于20 µL RNP复合物中。每个电穿孔的最终浓度为2.2 µM SGRNA，1.9μmCas9核酸酶和5 µM Cas9电穿孔增强剂。使用CM-137电穿孔程序，使用4D-核配置器械（LONZA）的X单位在核心维特条中电穿孔。电穿孔后，将细胞在37°C孵化器中休息10-15分钟，然后将其转移到带有NK细胞培养基和进料器细胞和IL-2的准备好的烧瓶中，并在37°C的孵化器中培养。使用以下引物通过蛋白质印迹或通过qPCR或PCR进行凝胶电泳评估CREM的KO效率：正向：5'-TGAATGAATGACTGTCCTCTCTGATGATGTGTG-3';反向：5'-CCTGAGTTGCTTCAATATAACTAGAGA-3'。通过蛋白质印迹测试了STAT3和STAT5A/B的KO效率。
使用霓虹灯转染系统（Invitrogen）进行UMRC3细胞中的CD70 KO。首先将SGRNA用无核酸酶的水稀释至44 µm的浓度。用R Buffer（Neon电穿孔试剂盒，Invitrogen）稀释Cas9，CAS9与R缓冲区的比率为3：2。将稀释的SGRNA和Cas9混合以形成RNP复合物，以1：1的比例，并在室温下孵育20分钟。收集UMRC3细胞，并用PBS在每个100,000个细胞的等分试样中洗涤两次。除去上清液，并将细胞与R Buffer中的电穿孔增强剂一起重悬于12 µL的RNP复合物中。每个电穿孔的最终浓度为1.8 µm SGRNA，1.6 µM Cas9核酸酶和2.25 µm Cas9电穿孔增强剂。使用霓虹灯转染系统在1,700 V，20毫秒脉冲宽度和1脉冲中用10 µL电穿孔尖端（Thermo Fisher Scientific，MPK5000）对细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到预热的DMEM培养基中，并在37°C的孵化器中培养。通过流式细胞仪评估CD70的KO效率。
GFP+ UMRC3或BCX.010球体是通过将20,000个单细胞在100μl培养基中镀在96孔透明的圆底圆底圆底型超级固定球形菌株（Corning，4520）的情况下形成的，然后是10分钟的偏心步骤120g。然后将板放在37°C的孵化器中24–48小时，以使球体形成。成立后，将球体在技术重复或一式一式一式一式井中以指定的E/T比例处理各种NK细胞条件，或者作为对照未经处理。在几天内以4小时的间隔捕获×10物镜（如每个实验中指定）。使用Incucyte S3 Live细胞分析系统（Sartorius）实时对绿色信号进行定量，并报告为球体绿色图像均值均值与绿色图像均值归一化为绿色图像，均值在NK细胞添加时间添加之前，均值均值。使用相同的分析系统导出视频或图像。
对于Raji肿瘤补偿测定法，将NK细胞与用麦克雷（MCHERRY）标记的Raji肿瘤细胞培养，并在96孔平坦的透明底部黑色微型板岩中将每2-3天添加到该培养物中每2-3天培养新鲜肿瘤细胞（Corning，3904）。每个井在每个补偿中接收到25,000个单一的Raji细胞，并且用于每种不同条件的重复或一式一式三份井。每个井的图像是在每个井的五个不同区域实时捕获的。使用Incucyte S3活细胞分析系统分析了麦克林荧光染料的肿瘤细胞计数，该系统可实时测量靶细胞的数量（荧光色素标记）。
将肿瘤细胞铺在96孔RTCA电子板（安捷伦）中24小时（以允许肿瘤细胞遵守板和生长），然后在指定的E/T比下添加NK细胞。仅添加了单独肿瘤对照的培养基。在XCelligence机器（Agilent）的间隔（Agilent）间隔15分钟内监测阻抗（每个实验单独指定），并报告为标准化的细胞指数，使用RTCA免疫疗法模块软件（Agilent）添加NK细胞时将其归一化为单元格指数。
对于使用Xcelligence进行的补偿测定，如上所述进行了第一个杀戮测定法。之后，每2-4天将新的肿瘤细胞每2-4天铺在新的96孔RTCA电子板上，并使用RTCA免疫疗法模块软件在Xcelligence机器中启动了新的杀伤测定法。将指示条件的NK细胞从先前的杀伤测定板转移到新板条的肿瘤上（24小时后），并在下一个补偿前的2-4天内监测阻抗。据报道肿瘤生长为标准化细胞指数。
如前所述57进行了质量细胞仪实验和一抗抗体结合。简而言之，收集细胞，用细胞染色缓冲液（PBS中的0.5％BSA）洗涤，并与2.5 µM顺铂（Sigma Aldrich）一起孵育，以进行生存能力评估。将细胞洗涤，用5 µL人类FC受体阻滞溶液（信任FCX，Biolegend）在室温下孵育10分钟，然后在室温下用新鲜准备的抗体混合物染色30分钟的细胞表面标记。用细胞染色缓冲液洗涤后，将样品固定并在4°C的黑暗中使用BD细胞膜/细胞对溶液透化30分钟，用PERM/WASH缓冲液洗涤两次，并用针对细胞内标记的抗体染色。然后将样品洗涤并在500 µL的1.6％多聚甲醛（EMD Biosciences）和PBS中储存过夜，并用125 nm虹膜核酸介导剂（Fluidigigm）进行PBS。第二天，将样品洗涤，过滤，计数和重悬于Milliq DH2O中，并补充EQTM四个元素校准珠，浓度为0.5×105。使用Helios（V.6.5.358）采集软件（Fluidigigm）在Helios仪器（流体）上采集样品。使用了以下抗体和相应的金属标签同位素：CD45（标准生物工具，3089003b，Hi30，89y，1：167）;CCR6（Miltenyi Biotec，130-108-023，Rea190，141pr，1：250）;EOMES（Invitrogen，14-4877-82，WD1928，142nd，1：167）;CD127（标准Biotools，3143012b，A019d5，143nd，1：200）;GFP（Biolegend，338002，FM264G，144nd，1：250）;CD70（Biolegend，355102，113-16，145nd，1：500）;CD8A（Miltenyi Biotec，130-122-281，Rea734，146nd，1：167）;NKG2C（Miltenyi Biotec，130-122-278，Rea205，147SM，1：125）;Trail（Miltenyi Biotec，130-126-490，Rea1113，148nd，1：125）;CD25（标准Biotools，3149010b，2A3，149SM，1：337）;CD69（Miltenyi Biotec，130-124-326，Rea824，150nd，1：5,000）;2B4（Miltenyi Biotec，130-124-523，Rea122，151EU，1：5,000）;CD95（Miltenyi Biotec， 130-124-328，Rea738，152SM，1：500）;Pankir（R＆D Systems，Mab1848，180704，153Eu，1：337）;CX3CR1（Miltenyi Biotec，130-122-286，Rea385，154SM，1：125）;CD27（标准Biotools，3155001b，L128，155GD，1：250）;CXCR3（标准Biotools，3156004B，G025H7，156GD，1：167）;OX40（Miltenyi Biotec，130-095-212，Rea621，158GD，1：125）;CD11C（标准Biotools，3159001b，bu15，159tb，1：250）;T-bet（标准生物工具，3160010B，4B10，160GD，1：250）;Tigit（Miltenyi Biotec，130-122-310，Rea1004，161dy，1：125）;Ki67（标准生物工具，3162012b，b56，162dy，1：250）;BTLA（标准Biotools，3163009b，Mih26，163dy，1：67）;CD73（Miltenyi Biotec，130-120-066，AD2，164dy，1：125）;TIM3（Miltenyi Biotec，130-122-333，Rea635，165Ho，1：10）;NKG2D（标准Biotools，3166016b，On72，166er，1：334）;CREM（Creative Diagnostics，Cabt-B10032，4C6，167er，1：500）;KLRG1（Miltenyi Biotec，130-126-458，Rea261，168er，1：125）;NKG2A（标准Biotools，3169013B，Z199，169TM，1：500）;CD161（Miltenyi Biotec，130-122-347，Rea631，170er，1：500）;DNAM（标准生物工具，3171013b，Dx11，171yb，1：250）;CD38（Miltenyi Biotec，130-122-307，Rea572，172yb，1：500）;CXCR4（标准Biotools，3173001b，12g5，173yb，1：167）;PD1（Miltenyi Biotec，130-096-168，PD1.3.1.3，174YB，1：125）;lag3（Miltenyi Biotec，130-124-529，Rea351，175lu，1：125）;ICO（Miltenyi Biotec，130-122-304，Rea192，176yb，1：167）;CD16（标准Biotools，3209002b，3g8，209Bi，1：167）;CD57（Miltenyi Biotec，130-124-525，Rea769，115in，1：500）;CD39（Miltenyi Biotec，130-093-506，MZ18-23C8，PT195，1：100）;Perforin（标准生物工具，3196002b，B-D48，PT196，1：167）;GZMB（标准Biotools，3198002B，GB11，PT198，1：167）;CD56（Miltenyi Biotec，130-108-016，Rea196，106CD，1：167）;CD2（Miltenyi Biotec，130-122-348，Rea972，111CD，1：334）;HLA-DR（Miltenyi Biotec，130-122-299，Rea805，112CD，1：250）;NKP30（Miltenyi Biotec，130-092-554，AF29-4D12，113CD，1：167）;NKP46（Miltenyi Biotec，130-124-522，Rea808，114CD，1：125）;和NKP44（Miltenyi Biotec， 130-126-465，Rea1163，116CD，1：125）。
使用细胞库分析质量细胞仪数据。首先，使用FlowJo处理FCS文件，通过删除珠子，然后在IR-191和IR-193双阳性单元格中进行门控单线。通过PT-195（顺铂）低GFP – CD45+CD56+鉴定NK细胞种群。门控策略应用于所有文件。NK细胞的代表性门控策略显示在补充图1中。使用Downsample插件在Flowjo中随机采样了20,000个NK细胞事件的数据。来自代表相同条件的捐助者的归一化数据被串联。下游分析对每种条件的随机采样10,000个事件进行了分析。来自各种条件的NK细胞合并以创建单个T-SNE CUDA图。每个标记物的阳性人群在细胞库中盖好。使用Z分数将每个标记的平均表达式归一化，然后在层次上群集，并绘制为热图，并使用morpheus矩阵可视化和分析软件（Broad Institute）对每个标记的百分比叠加层覆盖。
如上所述刺激NK细胞。根据制造商的协议，使用Rneasy Plus Mini Kit（Qiagen，74134）提取RNA。使用iscript DNA合成试剂盒合成cDNA（Bio-Rad，1708891）。20μL的QPCR反应混合物包括10μLTAQMAN高级快速PCR Master Mix（Applied Biosystems，44444557），2μLCREM或ICER PRIMETIMETY STD QPCR分析（IDT），2μLCDNA和6μl无核水。使用了以下底漆。
CREM特异性外显子（ENSE00003481920; ENSEMBL GRCH38.P14;扩展数据图3A）由大多数CREM非ICER同工型共享：Primer 1（FWD）：5'-ActgaAtgaAtgaAtgaAtgaAtgaActgaActgtcctCtctCtcctGatg-3';底漆2（REV）：5'-GTACTGCCATGGTGGTAGCAATACT-3'。
ICER特异性外显子1（ENSE00001890657，ENSE00001427126或ENSE0000001925783; ENSEMBL GRCH38.P14;扩展数据图3A）：引物1（FWD）：5'-GATGTGTGTCAGTCAGTCAGTCAGTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTATCC-3';底漆2（REV）：5'-CCTGTGTCATCTCCAGTTACAG-3'。
ICER特异性外显子2（ENSE00001923116，ENSE00001835159或ENSE0000001384382; ENSEMBL GRCH38.P14;扩展数据图3A）：引物1（FWD）：5'-TCAGTCAGTTCCTTCTTCTTCTTCTCTCGTTCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATA-3';底漆2（REV）：5'-TCAAGCAGACACCACTTCA-3'。
QPCR是在ABI 7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行的。将ΔCT计算为靶基因的CT - 相应内部对照18S的CT。通过使用ΔΔCT方法将每个感兴趣的基因的量标准化到实验对照中来确定相对表达。
从先前的研究中获得了来自非耐疗法体内淋巴瘤的CAR19 – IL-15 NK细胞的SCRNA-SEQ数据。
在来自体内模型的数据中，保留了超过100 nk细胞的时间点的CAR19 – IL-15 NK细胞（输注之前和之后（第7和第14天和第14天）），并使用标准的Seurat Workflow58处理。简而言之，将数据归一化和缩放，并分别使用比例尺归一化的函数（）= 10,000和scaledata（）。使用FindVariableFeatures（）确定了总共2,000个可变基因。运行runpca（）和runumap（），使用20个主组件通过检查肘部图来生成UMAP嵌入。FindAllmarkers（）用于识别输注前后细胞之间细胞之间差异表达的基因，使用Wilcox测试，对数折叠变化阈值= 0。在调整后的P值下鉴定出差异表达的基因< 0.01 and absolute average log2 fold change >0.5。所有分析均在用Seurat（v.4.1.1）的R（V.4.0.1）中进行。使用CytoSig59从SCRNA-SEQ推断IL-15活性。
从公开可用的数据集获得SCRNA-SEQ数据，并分析了CREM表达。首先，从TISCH2数据库中下载了SCRNA-SEQ癌症数据集的各种细胞类型中的归一化CREM表达水平（可在http://tisch.comp-genomics.org上找到）60,61。为此分析包括具有可用数据的数据集。
为了研究不同类型癌症的微环境中Ti-NK细胞中的CREM基因表达，我们使用了如前所述的预处理的SCRNA-SEQ数据和Ti-NK细胞的模型，如先前所描述的26，已在Zenodo上提供（https://doi.org/doi.org/10.5281/zenodo.10111139393343）（http://nk-scrna.malmberglab.com/）。
为了分析不同类型的NK细胞中CREM基因表达，我们研究了可以从相关网站（https://collections.cellatlas.io/meta-nk）下载的上一个研究28中提供的SCRNA-SEQ数据集。使用基于Python的软件Scanpy进行了上述数据和相应绘图的分析。我们遵循了Scanpy软件官方网站（https://scanpy.readthedocs.io/en/stable/tutorials/index.html）中详细介绍的分析步骤。
基因表达和临床数据来自TCGA（https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas）。使用R包生存中实现的COX回归进行了CREM与生存的关联。在整个队列的水平和单个癌症（> 400个样本）的水平上进行生存分析，同时控制诊断时肿瘤阶段和年龄。对于完整队列的生存分析，我们还控制了肿瘤类型。
为了识别关键转录因子并量化其在胰腺导管腺癌SCRNA -SEQ DATASET27中其相应调节子的生物学活性，我们应用了单细胞调节网络推断和群集推断（Scenic）工作流程（如前所述）。简而言之，我们在高性能计算群集上使用了Python实现Pyscenic（默认参数）。使用Arboreto63中实现的GRNBOOST2算法从SCRNA -SEQ共表达模式推断出策划的转录因子和候选目标基因之间的调节相互作用。该过程生成了一个邻接矩阵，将每个转录因子与推定目标基因链接在一起以及重要性得分。接下来，我们组装了由每个转录因子及其相关靶基因组成的候选模块。为了区分直接和间接调节目标，仅选择启动子包含相关转录因子特异性DNA基序的那些基因，可以通过RCISTARGET MOTIF富集分析确定，从而完善了这些模块。然后，我们通过计算每个细胞的AUC来量化单个细胞分辨率的每个精制模块（调节）的相对生物学活性。使用Seurat中的FindMarkers函数鉴定了跨实验组的差异调节活性，我们通过生成具有DoHeatMap函数的缩放auc auc矩阵的热图，可视化了前50个差异活跃的调节（调整后的P <0.01）。
如前所述的64,65，在MDACC表观基因组学分析核心上进行了芯片测定，并进行了一些修改。简而言之，将20-30万个NK细胞（NT，IL-15，CAR70 – IL-15和CAR70）与1％甲醛交联10分钟，用125 mm甘氨酸淬火5分钟，持续5分钟，然后用染色剂制备和超声处理和超声处理，以获得200-600 bp的片段化。在其他实验中，将NT NK细胞以IL-15浓度升高（0、500和5,000 pg ML – 1）处理1或6小时。类似地，将NK细胞与1％甲醛交联10分钟，用125 mM甘氨酸淬灭5分钟，然后进行染色质制备和超声处理，以获得200-600 bp的片段大小。ChIP was performed overnight with antibodies specific to pCREB (9198, Cell Signaling Technology, 1:50) and pSTAT3-Y705 (9145, Cell Signaling Technology, 1:100), STAT5B (13-5300, Invitrogen, 1:50), CREB (sc-240, 1:175), CREM (CABT-B10032, Creative Diagnostics, 1:100) and IgG（2729，细胞信号技术）。第二天，使用DIAMAG蛋白A涂层的磁珠（Diagenode，C03010020）收集免疫复合物，洗涤并逆转过夜过夜，然后进行DNA提取。SYBR实时QPCR使用辅助和STAT3的推定启动子中的寡核苷酸检测到了感兴趣的DNA区域。下一代测序可获得大约3000万个50 bp配对的末端读数。测序是在MDACC先进技术基因组核心（ATGC）设施上进行的。
NT NK细胞，CREM WT CAR70 – IL-15 NK细胞和CREM KO CAR70 – IL-15 NK细胞单独培养或与UMRC3细胞以1：1的比率孵育24小时。之后，在MDACC北部校园流式细胞仪和细胞成像核心设施上收集了NK细胞并在BD生物科学ARIA II细胞分系台或Beckman Coulter Cytoflex SRT细胞分系仪上排序。将NK细胞分类在单细胞+Live+GFP – CD45+CD56+细胞上。根据制造商的协议，使用RNeasy Plus迷你试剂盒（Qiagen，74134）从NK细胞中分离RNA。使用KAPA滞留的mRNA-SEQ试剂盒（Roche）制备条形码，Illumina兼容的滞留的mRNA文库。简而言之，使用磁性寡核-DT珠捕获每个NK细胞条件的250 ng总RNA。珠子洗脱和清理后，使用热和镁将所得的polya RNA碎片。使用随机启动，然后是第二链合成，将DUTP掺入第二链中，进行第一链合成。修复所得的双链cDNA片段的末端，5'-磷酸化和3'-A尾部，并结扎光明的特异性索引适配器。纯化产物并富集，以生成具有九个循环的PCR周期的全长文库。标记为DUTP的链没有放大，这导致了特定于链的库。使用Qubit DSDNA HS分析套件对库进行量化，并使用4200 tapestation高灵敏度D1000屏幕截图（Agilent Technologies）评估尺寸分布，然后用每个池的24个库进行多路复用。使用KAPA库定量试剂盒（Roche）通过QPCR定量库池，并使用100个核苷酸配对格式在NovaseQ6000 SP流动池（Illumina）上测序。
使用NF核/RNASEQ管道（v.3.14.0）处理RAW FASTQ文件。所有样品通过内置质量控制。最终的读取映射数据以大翅格的格式和表达式定量矩阵中的成绩单（TPM）中用于下游分析和可视化图。
制备NK细胞，并分类为散装RNA-seq制备。根据先前描述的协议3,66，在MDACC表观基因组学分析核心上进行了ATAC – SEQ库制备，并进行了较小的修改。使用标记DNA TDE1酶（Illumina）对从NK细胞中分离的核进行标记，并使用Spriselect珠（Beckman Coulter）纯化所得的库。使用具有8个核苷酸单个指数的100个核苷酸PE格式在NovaseQ6000 SP流动池上测序库。
对于每个批量ATAC – SEQ样本，使用BWA67 MEM模式将来自RAW FASTQ文件的成对末端读取与人类基因组（GRCH38）对齐，并删除了重复的读取。ATAC – Seq读数的5'末端使用在DeepTools中实现的Arignmentsive模块移至转座酶的实际切割位点。使用成对末端读取信息使用MACS2（参考文献68）调用峰值。使用diffbind（v.3.8.4）69加载了来自多个样品的MacS2输出。来自多个样品的峰集使用diffbind中的useummarizeOverlaps函数中的样本中的重叠。使用DeepTools（v.3.5.2）70可视化整体染色质开放度。使用Jaspar Motif数据库（2020版）72中的Signac（v.1.12.0）71中的函数Runchromvar（V.1.12.0）71计算每个样本的主题活动。使用Signac73中实现的聚合方法计算每个样品的基因活化。
芯片序列数据的读取处理与ATAC – SEQ相同。我们通过可视化沿基因体的覆盖范围富集进行了质量控制，并过滤了两个样品（来自CAR70 – IL-15 NK细胞状况中的两个供体），这些样品没有显示TSS区域的富集。因此，这些样品被排除在分析之外。当使用chipseeker（V.1.38.0）74检测到峰值时，调用每个样品的目标基因，如果与配对输入（对照）样品重叠，则将靶基因删除。当条件之间的log [tpm]中的折叠变化大于0.3时，调用了顶部目标（与RNA-Seq对齐时）。使用超几何测试（Hyper Package（V.2.0.0）75）进行基因集的功能富集。使用GSEA（FGSEA软件包（V.1.28.0）76）进行了条件之间基因集的差异富集。使用epiwraps（https://github.com/ethz-ins/epiwraps）使用BigWig文件作为原始输入来进行基因组轨道可视化。
图5E是使用CREM KO与WT CAR70 – IL-15 NK细胞中上调和下调途径的GSEA制备的，该途径由大量RNA-Seq评估。对于此GSEA，在每个标志途径中仅考虑CREM芯片seq的CREM的直接靶标。图5H也代表GSEA。如前所述，应用GSEA通过评估基因组成员是否通常排名在排名基因列表的顶部或底部，并具有与单侧Kolmogorov-Smirnov测试有关的模型，以测试给定基因集的富集。
所有涉及小鼠的程序和实验方案均根据美国兽医医学协会和美国国立卫生研究院的建议进行，并根据由MD Anderson癌症中心机构动物护理委员会批准的方案（协议编号00001263-RN01）批准。我们为小鼠实验使用了8-10周龄的NSG小鼠用于异种移植模型，以评估体内CREM KO CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。在适用的情况下，根据肿瘤大小进行治疗前随机分组小鼠，以确保所有组之间的肿瘤负担相同。小鼠是由对治疗组视而不见的操作员注射和治疗的。病理分析是由病理学家进行的，他对治疗组和预期结果之间的差异视而不见。
对于Burkitt淋巴瘤Raji模型，NSG小鼠用300 CGY辐照。第二天，小鼠静脉注射了20,000个萤火虫荧光素酶标记的Raji细胞。然后在同一天向小鼠注入指示条件的NK细胞通过尾静脉。为了模拟疲惫，我们在亚治疗剂量（4×106 CAR+细胞）上使用了较旧的CAR70 – IL-15 NK细胞（23天大）。使用每周的生物发光成像（光谱仪器成像（SII）系统）监测肿瘤生长。信号定量是使用AURA（V.4.0.7）确定的平均辐射率（P S – 1 cm – 2 SR – 1）。在治疗后的第10和20天，随后遵循小鼠的生存或安乐死的定时安乐死。为了研究NK细胞植入，在NK细胞注射后的第10和20天收集了血液，并通过流式细胞仪进行分析。对于接受定时安乐死的小鼠，收集了肝脏，肺，脾脏和骨髓。处理器官并染色以通过流式细胞仪评估NK细胞的植入，或合并以进行离体功能测定。根据制造商的协议，使用以下试剂盒进行组织处理：肺解离试剂盒，鼠标（Miltenyi Biotec，130-095-927），肝解离试剂盒，小鼠（Miltenyi Biotec，130-105-807）和Spleen解离试剂盒，Miletenyiiiiiiieec，13095-0-0-0-0-0-0-0-0-095-0-095-095。
在乳腺癌的转移性PDX小鼠模型中，雌性NSG小鼠在第-7天通过尾静脉注射了300,000 BCX.010细胞，然后在第-1天进行辐射。在第0天通过尾静脉注入NK细胞。我们进行了两个独立的实验：一项具有及时的小鼠安乐死的实验，另一项使用以下剂量注入的三个CB供体来存活。一个供体用于定时安乐死实验，并将两个捐赠者用于生存实验。NK细胞动力学的流式细胞仪分析是通过在注射NK细胞后的第10和20天进行血液进行的。为了研究NK细胞对BCX模型中NK细胞的有效性和迁移，在定时安乐死实验中，NK细胞注射后的第35天将小鼠安乐死。收集，固定和石蜡包裹肺和肝脏。肿瘤结节通过病理学家通过肺和曙红（H＆E）使用明亮场显微镜对肺和肝脏切片进行染色。对HCD45和GZMB的免疫组织化学染色分别在肺和肝脏切片上进行，以鉴定NK细胞和细胞毒性NK细胞。在相邻串行截面的HCD45和GZMB上，使用Aperio AT2对APERIO AT2进行了整个幻灯片数字成像。在Halo（v.3.6）反卷积模块（V.1.1.8）中对图像进行反驳。随后使用相同的光晕软件进行注册并融合了反价vol的图像。
为了研究CREM KO CAR-NK细胞的安全问题，我们根据BCX.010输注模型进行了体内实验。如上所述，用CREM WT或CREM KO CAR70 – IL-15 NK细胞处理了植入BCX.010细胞的小鼠1周后。作为对照，将CREM KO CAR70 – IL-15 NK细胞注入没有肿瘤的小鼠中。两周后，在NK细胞植入的峰值上，将小鼠安乐死，并由一名由美国兽医学院认证的兽医病理学家评估了重要器官（肝脏，肺和肾脏）部分的组织学。还从CREM WT或CREM KO CAR70 – IL-15 NK细胞治疗后30天还从另一组小鼠那里收集血液，并分析血液学参数和化学，以评估急性和亚急性毒性。对于BCX.010体内实验中的模型，根据每个供体的体外活性，以1或3×106细胞的剂量注入NK细胞。
对于人类胰腺癌的原位小鼠模型，NSG小鼠将300,000个PATC148细胞直接进入胰腺外科原位植入。一周后，辐照前一天后用指定的NK细胞产物（5×106细胞）对小鼠进行腹膜内治疗。在NK细胞处理后的第10和20天，同样抽取血液。为了通过组织学评估肿瘤负担，在NK细胞治疗后的第36天对小鼠进行了安乐死。收集胰腺，固定并嵌入石蜡。病理学家在H＆E染色后定量肿瘤结节。
根据制造商的协议，使用敏捷的海马XF分析仪（Agilent）测定了根据氧气消耗率（OCR）测量的基于细胞外酸化率（ECAR）和线粒体呼吸测量的糖酵解。使用2 g L -1-葡萄糖，2.5μm寡霉素和50 mM 2-脱氧葡萄糖与Hoechst 33342（Invitrogen）染料混合使用海马糖酵解应激测试。使用2.5μM寡霉素，0.5μMFCCP和0.5μm烤烤烤甲霉素A与HOECHST 33342（Invitrogen）染料混合使用Seahorse Mito应力测试。使用每个生物供体重复的技术三份。测定后，使用活细胞成像和计数在细胞1机器中计数可持续的细胞。显示了每1,000,000个活细胞的归一化OCR或ECAR数据。使用以下公式计算基础呼吸：在初次注射之前进行 - 非单位呼吸速率之前的最后速率测量。该值代表紫藤酮 - 抗霉素A处理后的最低速率测量值。使用以下公式计算最大呼吸：FCCP注射后的最大速率测量 - 非单位软体呼吸。基线糖酵解代表非糖酵解酸化（葡萄糖注射前的最后速率测量）。使用以下公式计算糖酵解能力：寡霉素注射后的最大速率测量 - 葡萄糖注射前的最后速率测量。
使用Mac 2023的Microsoft Excel收集并组织了数据。使用GraphPad Prism（Prism 9和10，GraphPad软件）进行了统计分析。使用ANOVA对多组（适用时进行多个比较）或两组的t检验评估定量差异。统计显着性定义为p <0.05。平均值±S.E.M.除非另有说明，否则被用来表示数据。每个图传奇中详细介绍了使用的特定统计测试和相应的样本量（n）。没有使用统计方法来预先确定样本量。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。