编码七谷（GPR155）的基因（Uniprot Q7Z3F1）被合成并取代为PTWIST CMV CMV BG WPRE NEO（Twist Bioscience），具有C末端标志，用于哺乳动物表达。对于昆虫细胞的表达，将七甘哥（Uniprot Q7Z3F1）合成并克隆（Genscript），并带有C端标志标签的PfastBac1（Thermo Fisher Scientific）。所有突变体均由位置定向的诱变（Genscript或内部）以及通过全质粒测序验证的序列产生。在整个研究过程中，我们通常比较了哺乳动物衍生的和昆虫衍生的重组七七裂，以尝试使用冷冻EM捕获不同的蛋白质构象。但是，我们对低温EM，表面等离子体共振，质量光度法和尺寸 - 排斥色谱法的评估显示，两种表达系统之间的七谷行为没有显着差异。将SLC10A1合成并克隆（genscript）与PfastBAC1（Thermo Fisher Scientific）一起使用C末端Twin-Strep-Tag用于昆虫细胞的表达。
对于哺乳动物的表达，在expi293f细胞（Thermo Fisher Scientific）中表达七裂，并在Expi293表达培养基（Thermo Fisher Scientific）中传递。将细胞用PEI：DNA比为5：1的聚乙基亚胺（PEI）最大（PEI）最大（POLYSCIENCES），最终DNA量为1.25μgml -1。重组蛋白在37°C下表达72小时，并补充5％CO2。通过离心收集细胞，并在纯化前在–80°C下冷冻。对于昆虫细胞的表达，在每种1-l培养物中用4毫升的杆状病毒感染后，在SF9细胞中表达了七七甘哥或指示突变体，该突变体通过遵循制造商的方案（BAC-to-BAC，Invitrogen）产生。通过离心收集细胞，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并在-80°C下储存直至使用。
将细胞重悬于含有20 mM HEPE（pH 7.4），150 mM NaCl，1％（w/v）Lauryl麦芽糖Neopentyl甘油（LMNG），0.1％（W/V）CHS和一个EDTA无EDTA蛋白酶抑制剂蛋白抑制剂鸡尾酒片（ROCHE）的缓冲液中。将细胞在4°C下孵育3小时，以溶解膜。随后，将溶解的材料以20,000 rpm离心1小时，然后通过0.8 µm滤光片过滤上清液。添加抗FLAG G1亲和力树脂（Genscript），并在4°C下在水平辊上孵育30分钟。通过离心收集国旗树脂，洗涤并转移到重力流柱（Biorad）中。将树脂用20列体积（CVS）洗涤0.1％（w/v）LMNG和0.01％（w/v）CHS缓冲液，其次是20 cvs的0.05％（w/v）LMNG和0.005％（w/v）（w/v）CHS。用0.1 mg ML -1 FLAG肽（Genscript）在0.002％（w/v）LMNG和0.0002％（w/v）CHS缓冲液中洗脱蛋白质。使用超糖色谱法浓缩含有蛋白质的馏分，并使用超糖色谱法6 10/300色谱柱（Cytiva）用20 mM HEPE（pH 7.4），150 mm NaCl，2 mm DTT，0.002％（w/v）LMNG和0.0002％（w/v/v/v）均衡。使用一个离心浓缩剂，在-80°C下存储之前，使用100 kDa分子量截止的离心浓缩剂将峰值浓度的浓度为40-50至约20 µm。SLC10A1-Strep在SF9细胞中表达，并如七裂所述进行纯化，只是使用1-ML streptrap XT XT预先包装的柱（Cytiva）代替了Flag-absstep step进行链球菌-TAG纯化，并且用50 mM生物素洗脱了蛋白质。
使用SF9细胞在含有10 mm HEPE（pH 7.4），300 mm NaCl，0.005％（w/v）LMNG，0.0005％CHS（w/v），0.0005％chs，0.005％np-40（v/005％np）的缓冲液中，使用SF9细胞在BIACORE T200（GE Healthcare）上表达重组七裂（GE Healthcare）进行表面等离子体共振实验。在25°C下以30 µl min -1的流速为25°C的亚硫氧化物（DMSO）。为了测量IAA（175.18 g mol-1）和色氨酸（204.23 g mol-1）与七谷的结合，我们产生了固定在CM7传感器芯片（GE Healthcare）上的高密度七裂。In brief, 1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) standard amine coupling was performed by passing LYCHOS at 200 µg ml−1 (1 µM, 193.8 kDa) in sodium acetate buffer (100 mM, pH 4.5) at 10 µl min−1.达到了25,000–30,000个响应单元（RU）的固定水平，以测量小分子配体（分别是理论上的RMAX ≈36–54，假设两个结合位点）。在这里，选择具有相似蛋白质折叠的已知钠/牛胆酸酯共转运蛋白的SLC10A1作为改善基线和非特异性效应的减法的参考。在测量之前，固定的七谷在30 µl min -1的运行缓冲液中稳定2到四个小时，以确保稳定的基线。为了最大程度地减少缓冲液不匹配效应，色氨酸和IAA的库存解决方案已达到500毫米。将pH调节为7.4，每种配体的双重连续稀释液用于运行缓冲液。IAA和色氨酸（20 mm至156.3 µm）的连续稀释液以升序注射60 s，并监测解离180 s。进行背负控制注射和针头浸入，以防止样品交叉污染。每个循环后用50％（v/v）DMSO洗涤在10 kHz下测量每次注射。进行参考和空白减法以说明漂移，散装和溶剂效应。亲和力，根据稳态曲线测量， 表示为四到七个实验重复的平均值。对于固定的WT（19,544 RU），L177W（30,981 RU），N145a（26,191 RU）和A148W（A148W（28,80,8008 RUCH）veros veros veros andiant andiant veros veros andiant lych siant lych siant lych siant，RMAX值为19.8±1.3、52.4±3.0、42.4±3.0、42.4±3.0、42.4±3.0、42.4±3.0和36.4±2.0。这些值与预期的理论RMAX一致，这表明绝大多数固定的七谷仍然处于活跃状态。至少使用了两种单独的蛋白质制剂进行亲和力测量，并对每个七谷型变体进行了五到八个实验重复。每个实验重复均由一个独立的浓度序列组成，该系列是用一对一的结合曲线建模的（如先前定义的31）。亲和力测量在独立的蛋白质制剂，传感器芯片和IAA溶液之间非常一致。
使用Pelco Easiglow仪器在30 mA处排放30 mA的Quantifoil R1.2/1.3 200网格铜网格。立即将新鲜纯化的甘露（在10 µm处为10 µm）施加到网格上，并在液态乙烷中迅速玻璃化。为了分析IAA和色氨酸相互作用，将每种配体的溶液以100 mm的形式进行，并将样品稀释至最终浓度10 mm。相比之下，使用15 mM的IAA浓度来确定IAA结合的PIN8结构21。在冷冻之前，将IAA和色氨酸与七裂60 s孵育。在一个例子中，七七七裂在冰上孵化2小时。用渔夫1级滤纸手动吸毒后，用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）进行玻璃化过程。与100％相对湿度保持在4°C的温度。在泰坦krios G1（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜上收集数据，该显微镜在300 kV的情况下使用50μmC2光圈。使用Gatan K3直接电子检测器以105,000×的名义EF-TEM放大倍率获得显微照片，对应于校准的物理像素大小为0.8234Å。使用GATAN GIF量子滤波器，其缝隙宽度为10 eV。电子剂量速率设置为10.7电子像素-1 s -1，总暴露时间为3.77 s，累积剂量为60个电子，分布在60帧。使用EPU（v.2.12.1.2782）进行自动收集，并带有光束移动，并捕获每个阶段运动的21张图像。名义散焦范围设置在-0.5和-2.0 µm之间。
从Expi293F或SF9组织培养物中制备多种野生型七裂样品，用于电子显微镜。总体而言，这些样品是不可见的。我们注意到，在这些比较中，网格变化和冰厚度（例如，在看相同的制剂时）会影响DEP域的稳定性，而DEP域很容易变性。我们与（PDB 8U5N）和没有（PDB 8U54）IAA进行了SF9野生型七七裂的直接并排比较，均来自相同的蛋白质制备。同样，与色氨酸（PDB 8U58）的Expi293F产生的野生型七七裂（同一批次）进行直接比较，IAA（PDB 8U5Q，8U5V和8U5X）或没有配体（PDB 8U56）（PDB 8U56）。在这里，我们报告了两种野生型七裂的重建，它们产生了最高分辨率（PDB 8U56； Expi293F）和最完整的序列覆盖率（PDB 8U54; SF9）。在与IAA（PDB 8U5Q，8U5V和8U5X; EXPI293F）和色氨酸（PDB 8U58; Expi293f）短暂孵育后，我们收集了另外两个数据集。最后，我们研究了W678R/F352a七七裂突变（PDB 8U5C； SF9）和七七裂（PDB 8U5N; SF9）。
总共收集了六个数据集，电影从4,000到16,000不等。校正了剂量分级的电影，以进行梁诱导的运动，并补偿MotionCor2（V.1.1.0）内的辐射损伤32。随后将剂量加权的对齐，剂量加权的平均值进口到CryoSparc33中，以进行所有进一步的处理。用CTFFIND（v.4.1.8）34或基于贴片的CTF估计估算对比传递函数（CTF）参数。丢弃了5Å或更高的刺戒指的显微照片。首先，在Cryosparc33中进行了多个回合的自动攻击和斑点拾取，然后进行粒子重复的去除和二维（2D）分类。干净的课程用于培训Topaz35型号。此模型随后用于所有数据集。在单体七七裂（与IAA长期孵育）的情况下，进行了额外的斑点拾取，以确保省略任何颗粒。
所有颗粒最初都在400×400像素盒中提取，并通过傅立叶裁剪到64个对应于5Å像素-1的像素大小对应于64个。在关系（v.3.1，4.0b）36和Cryosparc33中，对这些进行了多个回合的2D分类，从而产生了三维（3D）分类的足够质量和同质性的颗粒。通常，这是一次仅用于删除清晰的误报和污染的一次。将它们重新提取，中心并下采样至128×128，像素大小约为2.5Å像素-1。该集合使用四个类（分别设置为5Å和12Å的最大分辨率和12Å；傅里叶半径步骤，0.08；初始和最终minibatch，1,500）进行滤波粒子。通常，选择一个体积以进行进一步完善。将颗粒在1.1Å像素-1左右重新提取，并用C2对称性进行不均匀的细化，平均得出3.3Å地图。
在Relion36中进行粒子抛光，重新提取颗粒的最终像素大小为1.108Å像素-1，然后重新构成颗粒。在这里，进行了另外一轮的AB粒子分类。在七七裂（短期孵育）的情况下，有两个人群很明显，其中GPCR结构域似乎是从两个不同构型中取样的。进行了对称扩展和集中分类，然后进行重建而没有其他角度搜索。使用EMAN（v.2.2）37进行软件之间的转换，并用内部或PYEM编写代码。傅立叶壳相关（FSC）用于在0.143阈值下估计分辨率。通过CryoSparc33中实现的窗口blocres FSC方法（0.5阈值）估算局部分辨率。进行了CryoSparc33和Emready38中的地图锐化，以协助残留分配和模型构建。
首先，使用具有48 GB的VRAM的A6000 GPU生成了Alphafold16的C2对称模型，该模型是由Alphafold16生成的。将该模型的域和适当的接口分开，并将刚体安装到Emready38锐化的地图中。使用COOT39，ISOLDE40和CHIMERAX41的组合手动重建几个区域。最后，使用谐波电位约束在Phenix（V.1.20.1）42中进行了真实空间细化。所有图，分析，视频渲染和可视化均在Chimerax41或Python和Matplotlib中产生。
SSM电生理学是在SURFE2R N1（Nanion Technologies）上进行的。购买了电极传感器（3毫米）（Nanion Technologies），并根据既定协议21,43制备。首先，为了确认传感器保真度，在非激活缓冲液（20 mM HEPES，pH 8.5、150 mM NaCl和1 mM MMGCL2）中进行了电容和电导测量。理想的传感器具有60 nF至80 nF的电容，电导率在10 ns至50 ns之间。接下来，将传感器用超纯水冲洗，在温和的N2（g）流下干燥，并在25°C下用50 µL的0.5 mm 1-二十烷醇（Sigma）处理30分钟或在4°C过夜。为了防止蒸发，使用倒数蒸馏水的倒置培养皿形成密封。通过反转传感器并轻轻敲击传感器以滤纸去除去硫醇溶液，然后用100％（v/v）异丙醇和超纯水进行大量冲洗。传感器再次在温和的N2（g）流下干燥。为了制备SSM，将溶解在N-雄烷中的1,2-二羟基磷脂酰胆碱（Avanti）的7.5 mg ML-1溶液的2.0 µl液滴直接使用汉密尔顿移液器直接应用于清洁和干燥的金表面，以确保3 mM Sensor表面均匀覆盖。立即使用50 µL的非激活缓冲液，并将SSM放在25°C的气密室中，在25°C下组装1小时。传感器再次被验证以进行电容和电导。
为了制备裂解囊泡，10 mg大豆磷脂混合物（38％W/V磷脂酰胆碱，30％W/V磷脂酰乙醇胺，18％W/V磷脂酰肌醇，7％W/V型磷脂型，7％W/V磷脂型酸和7％W/V pistect and vial and vial and vial ripied ripied rited rited rited rited ried dried drest rite dried drest drest drest restied; avantied；（g）。然后将脂质膜重悬于激活缓冲液至3 mg ml -1中，并通过聚碳酸酯过滤器（Ø200nm）挤出以形成单层囊泡。lair方法44组装了含有七谷的蛋白质体。在这里，将5 µg野生型七谷（SF9; 3.6 mg ml-1，17 µm）稀释到10 µl脂质体中，并允许孵育15分钟，然后再用40 µL非激活缓冲液进一步稀释。接下来，将50 µL蛋白脂质体应用于制备的SSM，并在25°C下以4,000克的速度在25°C下以定制的3D打印设备离心30分钟。随后将传感器用非激活缓冲液洗涤。
进行了典型的单溶液交换实验。简而言之，在给定浓度下进行的单个测量由1-S脉冲在200 µl s-1处的1-S脉冲组成，以建立基线，立即（<30 ms）注入1-S脉冲激活缓冲液以诱导瞬态电流，并诱导非激活缓冲液的1-S脉冲，以将系统交换为回到静止状态（总计3 s））（总计3 s）。每次测量之后，进行非激活缓冲液的2-S脉冲以平衡传感器。记录了当前瞬变的IAA（0–30 mm）的全浓度系列。对于每个浓度系列，进行了相应的空白传感器测量序列。对至少两个单独的传感器进行了测量。每个浓度序列是独立进行的，总共进行了四个实验重复（如前所述21）。最后，为了描述响应IAA的峰值电流，我们将Michaelis -Menten曲线拟合到峰值电流后，在空白的减法和归一化之后（I/IMAX，在传感器之间考虑了不同数量的七谷）。
为了评估裂解样品的化学计量和质量分布，使用活跃的抗振动平台上的TWOMP仪器（Refeyn）在20°C下在20°C下进行标准的质量光度计着陆测定法。从Refeyn购买了硅胶垫圈和玻璃盖板。通过在100％（v/v）异丙醇，超纯水以及血浆发光放电的100％（v/v）的超声浴中清洗玻璃盖玻片。为了避免源自LMNG胶束的噪声，将每个样品保持在20 mm HEPES，150 mM NaCl，0.002％（w/v）LMNG和0.0002％（w/v）CHS中，直到测量为止。然后将样品稀释为20倍至无洗涤剂缓冲液，然后立即测量60-120 s的图像系列。测量时的最终蛋白质浓度为20 nm。在同一天测量牛血清白蛋白（Merck）和丙铁蛋白（默克）的标准标准，以校准与质量对比的提取颗粒。图像系列以488 nm的8 ms暴露（128 Hz）获取，固定的视野为12×17 µm。施加框架和像素箱，分别为3和6，有效像素大小为72 nm。使用Refeyn Aquiremp和DiscoverMP软件包（v.2.5）进行分析和获取。为了研究七谷与IAA的长时间孵育的作用，在室温下将样品（SF9或expi293f衍生）与有或没有IAA孵育2小时。在这里，我们观察到与IAA孵育后SF9或Expi293F衍生的蛋白质之间没有差异。通过在添加10 mM IAA之前立即测量每个反应来获得时间零样品。
HEK293细胞（ATCC；对支原体污染的阴性，未经身份验证）在补充了5％（v/v）胎儿牛血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养。IAA FRET生物传感器Auxsen的序列是M. Kolb27的礼物，生物传感器被商业合成（Genscript）（Genscript）纳入PCDNA3.1（Thermo Fisher Scientific）。PCDNA3-LYSOTORCAR构建体是J. Zhang的礼物（Addgene质粒64929; http://n2t.net/addgene:64929; rrid：addgene_64929）。对于Lysotorcar分析，将七七裂或七谷突变体克隆到带有C端标记标签的PCDNA 3.1（Thermo Fisher Scientific）中。对于Auxsen外排测定，将七裂合成并克隆到具有C-末端标志标签的PTWIST CMV BG WPRE NEO（Twist Bioscience）中。作为对Auxsen分析的阳性对照，将编码PIN8的基因（Uniprot Q9LFP6）合成，并以N末端标记为PTWIST CMV CMV BG WPRE NEO（扭曲生物科学）。lychos-flag-nluc和ha-cpmcitrine-nprl2构建体是内部生成的，并通过吉布森组装（Gibson Assembly）克隆到pcDNA 3.1（Thermo Fisher Scientific）中。CPMCITRINE和NLUC的基因是从Bret Biosansor营地Camyen45的cam camcrone子，这是B. Hoare的礼物。从PfastBAC1表达载体（请参阅“蛋白质表达和纯化”）获得甘草基因，并从prk5 ha-nprl2（来自D. Sabatini和K. Shen（Addgene Plasmid 99709; http：/////////n2t.net/addgendgenne：9999709; RID）的礼物中; RID.999709; RID。使用重叠延伸PCR，Gibson组装或快速截图诱变，在内部生成了所有七七裂变体。β2-肾上腺素pectoror-nluc的结构是C. W. White和S. J. Hill的礼物。
使用25 kDa线性PEI以1：6 DNA：PEI的比例将HEK293细胞转染并在六孔板中的悬浮液中播种。将这些细胞与IAA，Auxsen27（每孔200 ng）和空载体控制的FRET生物传感器一起转染，以每孔为1μg，七谷（WT）或FLAG – PIN8，以将谷胱甘肽和PIN8错误地化为质膜（Extended Data Data（Extended Data）（Extended Data）（Extended Data（Extended Data）（Extended Data。24小时后，将细胞重新播放到涂有光的黑色，光学透明的96孔板（Perkin Elmer Viewplate）中，并固定24小时。在实验当天，除去培养基，并在室温下在汉克平衡的盐溶液（HBSS； Invitrogen）中平衡细胞。如前所述46，使用Olympus Lucplanfln 20×NA 0.45物镜和和谐软件（v.4.8）进行荧光成像，如前所述46，并进行了一些修改。为了进行发射比分析，使用520-560 nm和460-500 nm发射过滤器测量的发射依次激发细胞（410-430 nm激发滤波器）。每1分钟对细胞进行一次成像。在成像之前，如前所述，将25μMNPA添加到PIN8转染的细胞中。在添加10μMIAA之前，将基线发射比捕获5分钟，并捕获涌入发射比图像15分钟（以允许IAA涌入达到稳定的高原）。然后将IAA除去，然后将细胞放入没有或25μMNPA的HBS中（如前所述），然后捕获出排比率图像25分钟。如前所述，使用内部自动宏（V.2.14.0/1.54F）47分析数据。使用Microsoft Excel（v.16.45）选择了IAA涌入后F/F0变化大于10％的细胞（相对于每个细胞的基线比率）。数据表示为相对于总IAA涌入（加入IAA后15分钟）的平均排放率和每个单元的外排（缓冲液交换后25分钟） （f/finflux），并在每个生物复制上平均。为了确定外排（k）的速率，使用平台拟合数据，然后在GraphPad Prism（v.10.0.3）中进行单相衰减非线性回归模型，X0约束至0，Y0限制为1，而高原限制为0。显示为0。所显示的数据是从三个独立的生物学重复物中获得的。
HEK293细胞在六孔板中与用于MTORC1的溶酶体局部定位的FRET生物传感器，用于MTORC1，Lysotorcar29（每孔500 ng）和空的载体控制，Lychos – Flag（wt），Lychos – Flag（Y57A），Lychos – flag（y57a），lychos – flag（y57a）（lychos – fl35522a）（F352A/W678R），七七裂（N145A）或七绿色（F362A/W678R/N145A）（每孔500 ng），使用X-三分法为1：3 dna：试剂比率。24小时后，将细胞重新播放为黑色，光学清晰的96孔板（Perkin Elmer Viewplate），并用聚赖氨酸预先涂层。六个小时后，细胞在DMEM（无FBS）中饥饿过夜。在实验当天，使用具有Olympus lucplanfln 20×Na 0.45物镜和和谐软件（v.4.8）的高含量Perkin Elmer Operetta在荧光成像之前，在37°C的HBSS中在HBSS中饥饿1小时。使用520–560 nm和460-500 nm发射过滤器测量发射，顺序激发细胞（410–430 nm激发滤波器）。每分钟对细胞进行一次成像。在完全缓冲液与单独的无红DMEM交换之前，将基线发射比捕获5分钟（对照），或含有1.3％（w/v）甲基-β-环糊精（MβCD）（胆固醇消耗）或0.1％（w/v）MβCD/50μm氯酯酯素（cholesterol）（胆固醇消耗）（胆固醇消耗）（胆固醇）（胆固醇消耗）（在完全缓冲MβCD处理的细胞交换之前，将发射比图像捕获40分钟，至0.1％（w/v）MβCD/50μM胆固醇复合物（胆固醇补充）。捕获发射比图像再捕获30分钟。使用斐济（V.2.14.0/1.54F）和内部自动宏分析了Auxsen Fret生物传感器的数据。苯酚无红DMEM的添加会导致自动荧光变化，并使用Microsoft Excel校正（V.16.45）。数据表示为每个细胞（f/f0）相对于基线的平均FRET比率变化，并在每个生物学复制中平均。刺激引起的AUC和倍数变化（相对于基线，平均五个时间点在峰值响应时， 或使用GraphPad Prism（V.10.0.3）计算了MβCD处理的最后五个时间点）。显示的数据是从三个或四个独立的生物学重复获得的。
使用25 kDa线性PEI以1：6 DNA：PEI的比例将HEK293细胞转染在六孔板中。细胞与25 ng的每井甘草-Nluc WT，N145A，F352A/W678R或F352A/W678R/N145A或25 ngβ2-adrenoceptor-nluc（阴性对照），以及CPMCITRINE NGL2（0 NG，NG，NG，NG，NG，NG，27 ng），或增加405 ng，810 ng或1,200 ng）。使用空载体，每孔的DNA总量最高为1,225 ng。24小时后，将细胞以四碱涂层的白色不透明的96孔板（Perkin Elmer培养板）为5×104个细胞，将细胞重新培养为每孔5×104个细胞。再过24小时后，将细胞洗涤并用测定缓冲液（HBSS中的10 mM HEPE，在37°C时pH 7.4）平衡25分钟。然后将细胞与纳米核底物在37°C下孵育5分钟（1：1,000； Promega N1120）。用Lumistar Microplate读取器（BMG LabTech; Omega Control Software v.6.20）获得了BRET测量，从而在单个孔中可以同时同时测量发光（NLUC； 445–505 nm）和CPMCMCITRINE发射（505-565 nm）。在实验结束时，用482–512 nm的激发测量了总CPMCITRINE荧光，使用ClarioStar Microplate读取器（BMG Labtech，智能控制软件v.4.20）来确定CPMCMC的相对量。BRET比率如下：CPMCITRINE发射（505-565 nm）/NLUC发射（445–505 nm）。数据表示为每种转染条件（细胞中每种蛋白质的相对表达）的净BRET比率相对于CPMCITRINE/NLUC发射的比率，并使用非线性回归单位特异性结合模型在GraphPad Prism中拟合（V.10.0.3）（V.10.0.3）以获得BRET5050（V.10.0.3）和BRET50（KD）和BRETMAX（kd）和BMAX（BMAX）（BMAX）（BMAX）。为了进行七谷突变体之间的比较，数据表示为每种条件的Bretmax的净BRET， 由非线性回归一站特异性结合模型确定。数据从三到五个独立的生物学重复。
为了确认溶血性实验的七七甘露群 - Flag WT或突变体的表达，使用X-trelemegene（如上所述），用相同量的DNA转染HEK293细胞在六孔板中用相同量的DNA转染（每井lychos-flag wt，y57a，y57a，y57a，y57a，y57a，y57a，y57a或n145a）。After 48 h, cells were collected in ice-cold PBS, and pellets were resuspended in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% v/v Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.1% w/v SDS, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail, 1 mM benzamidine和1毫米PMSF）。将细胞用搅拌在冰上孵育20分钟，然后在4°C下以14,000g离心10分钟，并回收上清液。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒对总蛋白质浓度进行定量，并在4–15％的迷你蛋白酶预铸凝胶（Biorad）上运行35μg。通过使用Trans-blot Turbo转移系统（Biorad）和标准SD转移方案进行电印迹，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中。用5％（w/v）BSA封闭膜，在TRIS-HCl-buffered盐水（TBS）中使用0.1％（v/v）Tween-20（TBS-T）中的0.02％（w/v）叠氮化钠封闭1小时。将印迹在4°C下与小鼠抗flag（默克，F3165; 1：5,000）或兔抗β-微管蛋白（细胞信号技术2146; 1：1,000）在5％（w/v）BSA，0.02％（w/v）tbs-t中的同氮中孵育过夜。将印迹用TBS-T洗涤3次，然后与Irdye 680山羊抗小鼠和IRDYE 800CW山羊抗兔荧光二级抗体（LIC 926-68070和926-32211）在5％（w/v）BSA，0.02％（w/v）中（w/s）（w/s）（w/s）（v）1小时。然后将印迹在TBS-T中洗涤3次，一次在TBS中洗涤一次，并用Amersham Typhoon 5（控制软件v.3.0.0.2）可视化带。用斐济（V.2.14.0/1.54F）确定条带的光密度法。数据相对于加载对照（β-微管蛋白）表示，并来自三个独立的生物学重复。
为了确认某些七绿色和国旗-PIN8被错误定位到质膜上，用于Auxsen实验（而不是在正常的转染条件下），将HEK293细胞转染并在六孔板上用少女 - flag（wt）或Flag-ppin8（pei pei pei pei pei pei pei in pei pei pei a）中，将HEK293细胞转染并播种。比率为1：6 DNA：PEI。24小时后，将细胞回收到黑色光学透明的96孔板（Perkin Elmer Phinoplate）中。24小时后，将细胞在冰冷的PBS中洗涤3次，然后在室温下固定4％（v/v）多聚甲醛15分钟。用PBS（每个5分钟5分钟）洗涤3次后，使用阻止缓冲液（5％V/v在PBS中的5％V/V正常山羊血清，室温为0.3％V/V Triton X-100）持续一小时，然后在室温下与室温孵育一小时，与小鼠抗Flag抗体（Merck，F3165; 1：1：1：1：1％）（1％VE/1％ver）在室温下孵育一小时。PBS中的Triton X-100）。将细胞用PBS洗涤3次（每个5分钟），然后在室温下与山羊抗小鼠Alexa488二抗（ABCAM，AB150113； 1：1,000）在抗体稀释缓冲液中孵育一小时。在PBS中进行了三个最终洗涤后，细胞保留在PBS中直至成像。使用配备水浸入40×HC PL APO CS2 1.10 NA物镜的Leica TCS SP8共聚焦显微镜进行成像。OPSL 488激光（498–622 nm发射）用于成像抗小鼠Alexafluor 488二级抗体与抗FLAG M2主抗体结合。所有转染条件均以一式两份进行，每个井捕获三个视野。显示了代表性的单细胞图像。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。