a–d, BRD0026 exhibits the same mode of action as NITD609 and showed moderate in vitro potency against asexual (EC50 = 0.346 μM) and late-sexual (EC50 = 1.98 μM) blood stages of the parasites and exhibited reduced potency against P. falciparum NITD609R (EC50 = 1.77 μM), a transgenic strain carrying a point mutation in恶性疟原虫ATPASE4（参考文献9）。恶性疟原虫ATPASE4是NITD609的推测分子靶标（参考文献9）。A，B，BRD0026的八个可能的立体异构体（R，S，R; S，S，S; S，S; S，S; S，S，S，S）具有活性。C，BRD0026的初始表征在PBS和低细胞毒性方面显示出良好的溶解度。D，用BRD0026处理导致寄生虫胞质Na+浓度迅速增加，而钙含量或甲氟喹处理的寄生虫保持了恒定的胞质Na+浓度。该结果表明，用BRD0026处理的寄生虫无法通过积极挤出阳离子来抵消Na+的流入，类似于NITD609的拟议机制（数据平均值±S.D。；两种生物学和两种技术复制）。E – H，

　　BRD7539目标并抑制恶性疟原虫Dhodh。BRD7539在肝脏（EC50 =0.015μm）和无性血液阶段（EC50 =0.010μm）的寄生虫表现出极好的体外效力，从而显着降低了针对PFSCDHODH19的效力。该菌株异源表达酿酒酵母Dhodh，它不需要泛氨基酮作为电子受体。因此，该转基因菌株对线粒体电子传输链功能的抑制剂具有抗性19。BRD7539针对三种不同的恶性疟原虫菌株进行了测试，该菌株的突变是其他抗疟疾剂靶向的：（i）TM90C6B菌株，在恶性疟原虫p. valciparum cipiparum cipiparum cipiparum cipiparum cipiparum cytotrome b（QO b（QO位点）和抗Compant to atova to atova quone15; atovapy15; tm90c6b菌株中。（ii）针对IDI5994选择的恶性疟原虫Cytbg33v突变菌株，并在恶性疟原虫细胞色素B（Qi位点）15的奎诺酮还原酶位点中包含一个点突变；（iii）针对Genz-666136选择的恶性疟原虫Dhodhe182d突变菌株，并在恶性疟原虫Dhodh基因73中包含一个点突变。BRD7539在针对恶性疟原虫Dhodhe182d菌株的效力上显示出约59倍的变化，而TM90C6B和恶性疟原虫CytBG33V菌株中的效力不受影响。BRD7539还抑制了体外生化测定法（IC50 =0.033μm）中的重组恶性疟原虫Dhodh，但不抑制人类直系同源物。总之，这些结果表明BRD7539靶向恶性疟原虫Dhodh。E，F，BRD7539的八个可能的立体异构体的两个（S，S，S和R，S，S）显示活性。G，体外生长抑制测定法显示，恶性疟原虫CytBG33V和TM90C6B菌株的活性没有变化，但在恶性疟原虫Dhodhe182d菌株中表现出十倍变化，表明BRD7539靶标P. falciparum dhodh，但不是Falcipipiparum cytoto cytoto cytoto cytoto cytoto cytoto cy。H，BRD7539在体外抑制了重组恶性疟原虫Dhodh，IC50为33 nm； 未观察到人类直系同源物的抑制作用（两个生物学和两个技术重复的数据是平均值±S.D。I – M，BRD73842目标并抑制恶性疟原虫PI4K。BRD73842对无性（EC50 =0.069μM），晚期血液阶段（EC50 =0.643μM）和肝脏阶段（EC50 =0.459μm）寄生虫表现出极好的体外活性。I，J，BRD73842的结构表示活动的立体化学（R Stereoisomer）。K，BRD73842的初始表征显示出良好的溶解度和有限的细胞毒性。为了深入了解BRD73842的作用机理，从四种独立培养物中对BRD73842进化了两种抗性恶性疟原虫线（总计超过4×109接种物，请参见扩展数据图2A）。经过超过3个月的药物压力，EC50值增加了约10至20倍。从每种文化中获得了两个克隆。序列分析表明，所有克隆在PF3D7_0509800（编码falciparum pi4k的轨迹）中包含非同义SNV（补充表3）。l，为了确认PI4K是BRD73842的分子靶标，该化合物是针对纯化的重组P. vivax PI4K蛋白进行测定的。BRD73842选择性地抑制了Vivax PI4K（IC50 = 21 nm）的激酶活性，而不是人类PI4K。恶性疟原虫PI4K已被确定为两个最近描述的抗疟疾化合物Kai407（参考文献20）和MMV048（参考文献21）的分子靶标。M，双相剂量响应曲线是恶性疟原虫PI4K抑制剂的特征（数据是平均值±S.D。；三个生物学和三个技术重复）。这项研究中报告的EC50值源自剂量 - 反应曲线的第一个过渡（由箭头指示）。