所有质粒均基于编码HIV-1NL4-3的所有蛋白质的质粒下质粒PCHIV42。PCHIV变体MA – SP1，NC – P6，MA – SP1：NC – P6，MA – NC和PR-已在8,39,43之前进行了描述。通过使用寡核苷酸5'-gagagacaggctttttttttttttttttttttagggaagggaaggagagagagctgggccttcccaccacaggg-3''和5'-CCCTTGTGGGAGCCCAGGTCTTCCTAAAAAAAAGAAGCCTGTCTCTC-3'。

　　HEK293T细胞（研究资源标识符CVCL_0063）在Dulbecco改良的Eagle的培养基，100 U ML -1青霉素，100μgml -1链霉素和10％胎牛血清中生长。遗传特征通过PCR单位核技术证实，定期测试细胞对支原体污染阴性。在80％汇合时，细胞在转染前一天将细胞分为T175烧瓶（Cellstar，Greiner Bio-One）。使用标准的磷酸钙转染程序，用PCHIV（每T175烧瓶70 µg）在每种变体的三个T175烧瓶中转染细胞。转染后48小时，收集组织培养上清液并通过0.45μm孔孔清除。将过滤后的上清液分层在20％（w/v）的蔗糖垫的顶部，并在4 C下以107,000g进行超速离心，持续1.5 h。将沉淀重悬于PBS中，并在-80°C下储存在等分试样中。为了定量，使用SYBR绿色产物增强逆转录测定法确定与粒子相关的逆转录酶活性44。

　　通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离颗粒（20％；丙烯酰胺：双晶酰胺30：1）。Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore) by semidry blotting and stained with the indicated antisera in PBS with Intercept (PBS) Blocking Buffer (LICORBIO) (sheep anti-CA, polyclonal, 1:5,000 (in-house); rabbit anti-NC, polyclonal, 1:400 (in-house)), followed by corresponding IRDye secondaryPBS中具有截距（PBS）阻止缓冲液（LICORBIO）的抗体（Donkey Anti-Sheep，1：10,000（Licor Biosciences）；和Donkey Anti Kantibbit，1：10,000（Rockland））。根据制造商的说明，使用LICOR ODYSSEY CLX红外扫描仪（LICOR BIOSCIENCES）进行检测。印迹显示在扩展数据中图2a。

　　制备纯化的HIV-1颗粒的所有冷冻EM样品并类似成像。将纯化的病毒以1：3（v/v）比在PBS缓冲液中稀释。将3 ml体积的稀释病毒样品应用于发光的量化量子2/2孔2/2孔碳网格，Cu 300筛网（Quanifoil Micro Tools），并使用Leica EM GP2（100％湿度，3.5 s 3.5 s，20°C）。将网格加载到泰坦Krios G4传输电子显微镜中以300 kV运行，配备CFEG电子源，Falcon4i直接检测器摄像头和Selectris X Energy Filter（Thermofisher Scientific）。使用EPU（V3）（Thermofisher Scientific）以电子事件表示（EER）格式收集图像。所有数据集以×130,000的放大量收集，导致像素大小为0.95Å，获取时间为3.75至4.15 s，总剂量为40 e -2。详细的数据采集参数和所有数据集的显微照片数量均在扩展数据表1中给出。

　　EER视频被渲染为8,000×8,000网格，并使用Relion-4.0（参考文献46）将傅立叶编写成4,000×4,000网格。这些视频是通过Relion-4.0 MotionCorr2算法进行运动校正，剂量加权和平均的。将剂量分为组成组，导致剂量为0.8 e-Å2。使用CryoSparc v3.3或v4.4中的PatchCTF算法进行对比传递函数（CTF）估计（参考文献48）。使用Cryolo（V1.7.6）49进行粒子拾取。对于每个数据集，使用随机选择的50-100个显微照片集中注释的训练数据集在Cryolo中进行了培训。训练采摘模型，通过使用Cryolo Boxmanager GUI手动和不加选择地覆盖病毒的完整表面，以将病毒与背景区分开（扩展数据图3-6）。

　　PR-MA的数据处理管道在扩展数据中总结了。总计9,942个运动校正的显微照片和3,568,755个粒子位置进口到CryoSparc v4.4（参考文献48）。从病毒表面上的大量任意位置中挑选出的颗粒，用480×480像素的盒子尺寸提取，傅立叶编写至180×180像素。第一步是对良好的未成熟CA层进行高分辨率重建，以生成CA位置和方向，以用作先验，以初始化MA层的完善。进行了两轮2D分类，其中选择了未成熟Ca层的一面和最高视图（1,630,811个颗粒），并进行了8个类别的异质性完善，C6对称性，并使用先前溶液的不成熟的不成熟结构，用于体外组合的HIV CAPSID（ELLOCN SCODE）（eleton Midcopy Bank）（EMDB）（emdb），emdb）（emdb）consition consection consement（emdb）emdb）。选择了代表MA和膜层的可见密度（805,005个颗粒）的CA层中解决的二级结构，并以480×480像素的盒子尺寸重新提取，并将傅立叶编写为416×416像素。根据空间分离去除重复的颗粒，并对可接受的颗粒（676,036个颗粒）进行另外三轮3D细化，并进行局部空间和角度搜索（局部细化），C6对称性施加，并施加了一个掩盖膜。在3D改进之间进行了局部和全局CTF修饰，结合了CryoSparc v4.4中实现的Ewald Sphere校正。之后，将粒子导入Relion-4.0，重新提取的盒子尺寸为480×480，并将傅立叶编写为416×416像素。然后，将颗粒在Relion-4.0中进行贝叶斯抛光（参考文献51）。将抛光的颗粒进口回CryoSparc v4.4，并进行最终的局部细化，从而导致最终的不成熟CA层的高分辨率集中图。

　　然后使用CA层的坐标预测MA层的初始坐标。为此，使用六倍对称性对称性扩展了CA重建（以六倍对称轴为中心）的颗粒，并移动盒子的中心的3D坐标以定义MA层的六个周围三倍轴的位置。然后使用新的盒子中心提取移位的颗粒（3,920,498个颗粒），其盒子尺寸为512×512像素，傅立叶编写为256×256像素。去除重复的颗粒，并用C3对称性重建所接受的颗粒。然后，将所得图用于减去与颗粒中未成熟Ca层相对应的密度。减法是未成熟的MA所必需的，因为未成熟的CA层否则主导了重建。在冷冻PARC v4.4中对减法颗粒进行三轮异质细化，并使用C3的对称性和八个类，并使用冷冻ET衍生的未成熟MA晶格（EMD登录代码EMD-13087）的重建，以较低的层次为单位，将较低的层次归为10Å。然后，将选定的颗粒（120,104个颗粒）进行非均匀的细化52，并用C3对称性和一个掩模包括MA和膜层，然后是局部3D细化，并带有仅包含MA层的掩模。

　　接下来，通过使用MA三聚体的精制位置来预测相邻的MA三聚体的位置（晶格扩展），从而扩展了数据集。To do this, the particles were symmetry-expanded with C3 symmetry (generating the two additional symmetry-related copies of each particle), the centre of the box was shifted to a neighbouring MA trimer, and the particles were re-extracted with a box size of 512 × 512 pixels and Fourier-cropped to 256 × 256 pixels.然后去除重复的颗粒。晶格扩展增加了数据集的大小，改善了我们的重建分辨率和地图的质量。进行了两次晶格扩展的迭代。为了鉴定包含有序的MA晶格的颗粒，使用10个类别对接受的颗粒（819,672个颗粒）进行了两轮3D分类，而无需搜索。如上所述，在两个3D分类之间进行了晶格扩展。选择了显示良好的MA层的类（174,245个颗粒），并进行最后一轮局部改进，施加了C3对称性和一个包含MA层的掩模，导致MA的最终地图，分辨率为5.8Å。

　　在扩展数据中总结了MA – SP1的MA的数据处理管道。总共14,222个运动校正的显微照片，并将5,704,512个初始粒子位置导入到CryoSparc v3.3中（参考文献48）。从病毒表面上的大量任意位置挑选出的颗粒，用512×512像素的盒子尺寸提取，傅立叶编写到192×192像素。第一步是对良好的未成熟CA层进行高分辨率重建，以生成CA位置和方向，以用作先验，以初始化MA层的完善。对粒子进行了两轮2D分类，并且选择了未成熟CA层的侧面和顶视图的类（2,969,039个粒子；扩展数据图4B）。为了加速计算，将选定的粒子分为4个大约相同的子集（每个子集（每个都包含约750,000个颗粒）。每个子集使用六类进行了异质细化，使用先前确定的体外组装HIV-1 Capsid（EMDB登录代码EMD-3782）作为开始参考50的结构（扩展数据图4C）。然后将来自每个批次的最高质量类汇总，以进行一系列的完善步骤。在粒子重新提取之前，它们的盒子尺寸为512×512像素，并进行粒子重新萃取之前，对它们进行了非均匀的3D细化，并且傅立叶编写为384×384像素。根据空间分离距离去除重复的颗粒，并通过局部角和空间搜索（局部细化）对可接受的颗粒（885,809个颗粒）进行3D细化，并施加的C6对称性和一个包含不成熟CA层的掩模。然后将颗粒进行局部CTF细化，然后再进行3D细化。重新提取颗粒，用512×512像素的盒子尺寸和傅立叶编写为450×450像素， 并再次受到本地CTF改进和局部3D细化的约束。然后，进行异质的细化，使用三类选择最高质量类别的所有剩余的低质量颗粒。然后进行全局CTF细化53和进一步的局部改进。之后，将颗粒进口到Relion-4.0并进行贝叶斯抛光51。将抛光的颗粒进口回CryoSparc v3.3，并进行进一步的3D细化和局部CTF细化，以生成最终的高分辨率不成熟CA重建（扩展数据图4D）。

　　然后，使用CA层的坐标来定义以Ma-layer焦点重建的初始坐标和方向。盒子的中心的3D坐标转移到MA层的三倍对称轴的中心，这可以在高分辨率CA重建中看到。然后，使用施加的C3对称性和仅包含MA层的掩模进行局部细化，而无需提供新的参考（扩展数据图4E）。接下来，通过使用MA三聚体的精制位置来预测相邻的MA三聚体的位置（晶格扩展），从而扩展了数据集。为此，用C3对称性（生成每个粒子的另外两个与对称性相关的副本）将粒子扩展到对称性上，并将盒子的中心移至相邻的六倍对称轴，然后以空间分离距离的基础去除重复的粒子。通过强制执行C6对称性，对所接受的颗粒（1,398,844个颗粒）进行了进一步的局部细化。粒子再次被晶格扩展，盒子的中心转移到相邻的MA计时器的三倍。去除重复的颗粒，并使用施加的C3对称性重建所接受的颗粒（5,486,693个颗粒），以生成最终的MA重建（扩展数据图4E）。

　　MA – NC的处理策略几乎与MA – SP1的处理策略，包括初始CA重建以及随后的MA细化步骤。数据处理管道总结在扩展数据图5中。

　　WT MA的数据处理管道总结在扩展数据中。与上述PR-，MA – SP1和MA – NC样品的情况相反，WT病毒体中没有未成熟的Ca层，因此MA直接被直接重建。从病毒表面上的大量任意位置中挑选的颗粒最初是用480×480像素的盒子大小提取的，傅立叶编写为240×240像素，并经过2轮分类的2轮分类，以识别和选择显示MA层的顶部和侧面视图（扩展数据图。图6B）。然后，将它们进行两轮异质改进，每个精炼都有四个类并施加了C6对称性，使用冷冻衍生的成熟MA晶格重建作为起始参考（EMDB登录代码EMD-13088；扩展数据图6C）。选择所得的最高质量类别（61,672个颗粒），并通过施加的C6对称性进行非均匀的3D细化52。根据空间分离距离去除重复的颗粒，然后使用由MA层组成的细化蒙版对可接受的颗粒（57,260个颗粒）进行3D细化（局部细化）进行3D细化。通过使用MA三聚体的精制位置来预测相邻的MA三聚体的位置（晶格扩展），从而扩展了数据集。为此，将颗粒用C3对称性（生成每个粒子的另外两个与对称性相关的拷贝）相称，盒子的中心转移到相邻的六倍对称轴，并以480×480×480 Pixels和Fourier-cropped tos 356×356×356×356 picters重新提取颗粒的盒子大小。颗粒受到局部CTF的细化， 然后是一轮当地的精炼。粒子再次被晶格扩展，盒子的中心转移到相邻的MA计时器上。再次除去了重复项，并最终用施加的C3对称性重建了接受的颗粒（898,502个颗粒）（扩展数据图6D）。

　　使用Rosettaemerald进行了使用协议，使用Rosettaemerald进行了自动化脂质候选候选者进入MA – SP1配体密度（胆固醇，PTDINS（4,5）P2，PTDINS（4,5）P2 P2，PTDINS（4,5）P2 P2，磷脂酰辛基，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺）。54。对所有结果的拟合进行了视觉检查，并使用USCF Chimera 1.15中的MAPQ确定所有配体拟合的Q分数（参考文献55）。根据Q得分，提供了每个配体的前十个拟合（扩展数据图7a）。

　　如Cryo-EM小节中所述，进行冷冻EM数据预处理和颗粒拾取。提取图像的盒子尺寸为480×480像素，并将其下采样至240×240像素，最终像素大小为1.9。在CryoSparc v4.4中手动选择了显示膜侧视图的突变体的2D类平均值。之后，根据参考类别将2D类重新定向，在该类别中，膜双层使用互相关垂直于2D类的Y轴定向（扩展数据图8）。然后，将沿MA层（平行于病毒膜内部小叶的截面）的像素值用1,024点插值，并以1D向量导出。使用HANN函数对矢量进行过滤，并将零填充到总计4,096个采样点。在MATLAB V2022A（MATHWORKS）中绘制了零填充信号的快速傅立叶变换，并分析了与MA晶格间距频率相对应的峰。所有信号处理步骤均在MATLAB V2022A（MATHWORKS）中执行。

　　肉豆蔻酰化的HIV-1 MA（MyRMA；蛋白质数据库登录代码2H3I）的溶液结构用作构建MA – SP1密度的初始MA结构。使用Alphafold（v2.2.0）56生成SP211–16的初始坐标，这些坐标大致拟合到USCF Chimera55中的SP2密度中。然后，使用手动调整将初始模型灵活地拟合到Isolde 1.3（以Chimerax 1.3）57,58中的密度拟合。然后在Phenix-1.21中进行一轮真正的空间改进。最终模型验证统计数据和地图到模型傅里叶壳相关性是在Phenix-1.21（参考文献59）中计算的，并在扩展数据表2中给出。

　　MA – SP1切割突变体成熟MA的3.1-Å分辨率图用于自动模型G1.0（参考文献60）原子模型预测。将盒子尺寸裁剪为128×128像素，仅考虑中央三聚体中内置的序列。ModelAngelo作业在Relion-5.0中使用默认参数运行。序列输入是HIV-1 GAG序列或无序列。之后，从中央MA三聚体中内置在侧袋冷冻EM密度中的序列通过Clustal Omega多序列分析工具进行分析并分析。ModelAngelo自动化模型构建和序列预测结果在扩展数据中显示了图7b – d。

　　表达质粒PET11B-MA用六分配的C端他的tag62编码HIV-1 PNL4-3 MA结构域。BL21（DE3）大肠杆菌蛋白质表达的大肠杆菌与PET11B-MA质粒和编码编码酵母N末端N-末端Myristoyltransferase的质粒共转化。如先前所述的17,63，对蛋白质表示并纯化，并进行了修饰。在含有100 mg l -1的氨苄西林和50 mg L -1的卡纳米霉素的溶菌肉汤培养基中，在180 rpm的37°C下生长细胞。当在600 nm（A600Nm）达到约0.6时的吸光度时，将15 mg l-1肉芽菌酸（Sigma-Aldrich）添加到溶菌性肉汤培养基中。30分钟后，用0.5 mM异丙基β-1-硫代乙型甲酰胺诱导细胞，并在180 rpm时在37°C下再生长5小时。之后，将细胞以3500克旋转，并将颗粒储存在-80°C下，直到进一步使用。为了纯化，将6 g的细胞沉淀在60 mL的裂解缓冲液中稀释（25 mM Tris pH 8，500 mM NaCl，2 mM TCEP和2 mM苯基甲基磺酰基氟化物），并超声2分钟。然后，将20 µL的苯并酶添加到裂解细胞中。将裂解液在冰上孵育10分钟，然后在10°C下以50,000 rpm旋转45分钟（Beckman Coulter，50.2 Ti转子）。收集上清液，并用聚乙烯亚胺处理为0.03％，在冰上孵育5分钟，然后在4°C下以10,000 rpm离心10分钟（Beckman Coulter，JA-25.50转子）。收集上清液，并将硫酸铵粉（约15 g）添加到冰上的上清液中，并持续搅拌直至观察到蛋白质沉淀，然后在4°C下在10,000 rpm下离心10分钟（Beckman Coulter，JA-25.50 Rotor）。将沉淀重悬于4 mL的结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8，100 mM NaCl，2 mM TCEP）中，并加载到用结合缓冲液平衡的Histrap柱（Cytiva）上。然后用洗涤缓冲液（20毫米Tris-HCl，pH 8， 100 mM NaCl，2 mM TCEP和20 mM咪唑）随后用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8，100 mM NaCl，2 mM TCEP和250 mM咪唑）洗脱蛋白质。收集了含有亚分的分数，并使用在含有缓冲液中平衡的SuperDex 75 16/600（Cytiva）通过凝胶过滤进一步纯化（20 mm Tris-HCl，pH 8，500 mm NaCl，1 mm TCEP）。收集含有黑霉素的分数并存储在-80°C下。通过质谱法证实了肉豆蔻酰化修饰的存在。

　　在包含60毫升侧入储层的清洁聚氟乙烯块中进行了2D结晶，结合了先前的方案64。将58毫升的结晶缓冲液（12 mM磷酸钠缓冲液pH 7.8; 2.5 mm乙酸钠pH 7.6; 150 mM氯化钠； 10％甘油）33,65添加到6个结晶储层中。此后，1 µL新鲜制备的脂质混合物模仿病毒膜的内部叶片（摩尔馏分：31％胆固醇； 6％POPC； 29％POPE； 27％Pops; 7％Ptdins（4,5）P2（4,5）P2（4,5）P2（34））中的9：1（V/V/V）浓度在9：1（v/v）氯法溶液中。小心地添加在每个缓冲区表面的顶部。然后将聚氟乙烯块在封闭的培养皿中孵育，并在块下方放置湿滤纸60分钟，以使脂质单层在空气 - 水界面形成。然后将2/2孔碳网格网格，AU 200元（量子微型工具）放置在每个储层的顶部。然后从侧入口将含有纯化的不玛的溶液注入每个储层中。水库中的最终浓度为12毫米。10分钟后，将PBS缓冲液中的HIV-1 SP2添加到6个实验储层中的3个，最终浓度为120 mm。将相同数量的PBS缓冲液添加到三个控制库中。将所有样品再孵育60分钟，然后使用Vitrobot Mark IV仔细地将网格从储层的表面抬起，并插入螺旋状（4 S blot Time; 3 blot; 3 blot力; 100％湿度）。

　　将网格装入在200 kV下运行的TALOS GLACIOS冷冻传输电子显微镜，并配备了Falcon4i直接电子检测器（Thermofisher Scientific）。对于每个网格，手动选择5个网格正方形，在每个正方形中，在EPU软件（V3）中随机选择了30个孔。在每个孔的中心中选择了一个单一的采集位置，从而自动从每个网格收集150个显微照片。将显微照片收集为40帧的视频，总剂量为40 e -Å2，放大倍数为×92,000，导致像素大小为每个像素1.20Å。视频通过RIEN-4.0 MotionCorr2算法46,47进行运动校正，剂量加权和平均。使用CTFFIND466进行CTF估计。将颗粒选为一个点的网格，该点被放置在4,000×4,000显微照片中的128个像素，每个数据集中有139,500个粒子（扩展数据图11B）。提取颗粒的盒子大小为256像素，傅立叶编写为128像素。然后将颗粒进口到CryoSparc v4.4（参考文献48），并进行两轮2D分类（扩展数据图11）。选择了显示2D晶体晶格的类别，这些类别的颗粒被认为是含有2D晶格的颗粒。所有六个数据集都以相同的方式处理。为了促进图4E – H中类平均值和模拟的视觉比较，使用斐济（ImageJ V1.54F）进行了类似的灰度。

　　HIV-1 Gagpol由PCMVΔR8.2（addgene质粒编号12263）表达。J. Binley提供了PCAGGS HIV-1JRFL GP160表达质粒。PN1 CYPA抑制质粒（由J. Grover制成）源自PEGFP-N1-CYPA。为了产生这种质粒，将人环蛋白A从HELA cDNA克隆，并使用ECORI和BAMHI位点插入PEGFP-N1。为了产生CYPA刺激性，编码了连接器序列GSGSSSGGGGGGGGSGSG的合成寡核苷酸，然后插入了Hibit肽VSGWRLFKKIS，插入了使用BAMHI和NOTI SITE的CYPA的EGFP替换EGFP。该结构基于G. Melikyan的类似设计。

　　通过定向诱变和吉布森组装构建了插科打裂解突变体。从先前的文献中重新创建了PCMVΔR8.2MA – CA，PCMVΔR8.2MA – SP1，PCMVΔR8.2MA – NC和PCMVΔR8.2MA – P6。MA – CA，MA – SP1，MA – NC和MA – P6 Gagpol序列的基因块是从扭曲生物科学上排序的，并与PCR通过PCR扩增的PCMVΔR8.2骨链使用新英格兰Biolabs的Gibson Assembly Master组合。PCMVΔR8.2MA – SP2和PCMVΔR8.2NC – P6的改变是使用位点定向的诱变创建的，使用PCMVΔR8.2MA – P6和PCMVΔR8.2分别作为模板构建。将这些片段与PCMVΔR8.2通过PCR扩增并使用与上述相同的方案与吉布森组装结合。

　　H. Gottlinger提供了表达人CD4的载体PCDNA-HCD4。Z. Matsuda30提供了PMX-PURO pH-PLC∂lgbit质粒。以下试剂通过美国国家卫生研究院（NIH）HIV试剂计划，艾滋病部，国家过敏和传染病研究所（NIAID），NIH：Indinavir硫酸盐，ARP-8145，ARP-8145和Ritonavir，Ritonavir，ARP-4622，ARP-4622，均由ARP-4622，均由AIDS，NIAID; NIAID；人CCR5表达载体（PCCCR5），ARP-3325，由N. Landau贡献。

　　使用Thermofisher科学的RPMI-1640培养基在5％CO2的情况下生长HEK293细胞（ATCCNO。CRL-1573）。将细胞以60％–80％的汇合度转染，并在转染前交换培养基。定期测试细胞对支原体污染的阴性。

　　通过使用聚阳离子聚乙酰基胺（pH 7.0，1 mg mL-1），通过将三个10 cm的HEK293细胞转染HEK293细胞的三个10厘米DNA的HEK293细胞（VLP）（VLP）（VLP）（VLP）（VLP）。在细胞培养基中，以最终浓度为1 µM indinavir和10 µM Ritonavir转染未成熟的VLP制剂。将质粒以1：1：1的GAG/ENV/CYPA-HIBIT比率转染。转染后2天收集细胞培养基，然后向沉淀细胞旋转5分钟。将上清液转移到38.5 ml超级离心管中，并在PBS中用5 ml无菌过滤的15％蔗糖涂层。然后，使用Beckman Coulter SW28 SW28摇摆桶转子以27,000 rpm的速度在4°C下，以最大131,453 RCF的超速离心在131,453 rcf中对VLP进行打击。除去上清液，并将病毒重悬于1：100体积（300 µL）无血清无CO2独立培养基（Thermofisher Scientific）中。将在蛋白酶抑制剂存在下产生的颗粒重悬于无血清二氧化碳独立培养基中，最终浓度为1 µM indinavir和10 µm Ritonavir。将每种VLP制剂以每个管子15 µL等分为20个试管，并在-80°C下储存直至使用。收集后，每种VLP的等分试样用于融合动力学测定，以最大程度地减少冻伤循环中的颗粒破坏。

　　根据制造商的说明，使用Promega的Nano-Glo Hibit裂解检测系统将VLP量在Hibit融合时进行标准化。每个样品测量三卷VLP（2 µL，4 µL和6 µL）。将板放在Promega Glomax Explorer GM3500多模片读取器中，并使用制造商的建议协议阅读。然后，用线性趋势线在Excel中绘制读数。趋势线方程用于计算包含3×107相对光单元的每个样品的体积。

　　参考文献中描述的纳米酸酯酶融合动力学测定法。修改了30个以实现融合事件的实时实时监控。简而言之，HEK293细胞用CD4，CCR5和pH-LGBIT的1：1：1的转染。24小时后，收集细胞，并将耐耐嗪（Promega）和Drkbit肽添加到溶液中，分别以1×和1 µg ml -1的最终浓度。用100 µL的细胞溶液制备白色96孔平底板，每孔约为2×104个细胞的密度。将准备好的VLP添加到井中，并在1,200 RCF和12°C下进行2小时进行脊柱。然后将板上覆盖无菌的气味*气体可渗透膜（美国科学，第9123-6100号）。在Promega Glomax Explorer GM3500多模片读取器中连续读取板，使用自动协议每24轮阅读井进行一次自动读取器，每24轮阅读井，而在37°C下每孔1.5 s的集成时间。将读数导出到Excel中，其中计算了相对光单元，然后处理成总融合的百分比。使用内部Mathematica代码（补充数据1；由A. Lee撰写）来处理总融合曲线的百分比，以生成每个样本的T1/2。使用GraphPad Prism v10.4.1绘制结果。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。