我们将研究局限于整个欧洲的自然或广泛管理的草原，旨在涵盖气候和土壤类型的最广泛范围。Our grassland network consisted of ten locations (referred to as countries) covering most biogeographical regions in Europe19 (Fig. 1a,b and Supplementary Table 1): alpine (AT, Austria), subarctic (SE, Sweden), Arctic (IS, Iceland), Atlantic (UK-Ox, Oxford and UK-La, Lancaster, both UK), boreal (EE, Estonia), continental (DE,德国），地中海（ES，西班牙和GR，希腊）和Steppic（俄罗斯Ru）。与收集站点相关的气候数据是根据1960年至1990年在2.5分钟分辨率的1960年至1990年记录的观测值，该观察结果是从世界CLIM数据库获得的。我们捕获了广泛的地图值，从俄罗斯的223毫米到奥地利的1,383毫米，而在瑞典的-2°C之间，垫子在西班牙的-2°C之间变化。季节性变异性因位置而异，西班牙的降水季节性最高（38毫米），而英国牛津（Uk-oxford）则最低（14毫米）。俄罗斯在温度季节性（38.5°C）和冰岛最少（14°C）方面变化最大。我们的目的是在平均温度最接近18°C时收集峰值微生物生物量的土壤样品，该土壤样品接近植被生物量，也就是说，在南部地区的春季，在春季，夏季，夏季，北部地区的雪融化。2018年5月，我们从俄罗斯，希腊，西班牙和爱沙尼亚收集了土壤，其次是6月，七月，奥地利和冰岛的德国和牛津，八月，兰开斯特和瑞典。
选择每个国家的三个重复地点，以涵盖欧洲草地中广泛的土壤类型，共有30个复制地点，密切位于国家内（相距0.05–11.76公里）。根据世界参考基础47（https://soilgrids.org），我们的研究包括七个土壤类型类别，其中大多数属于单位糖果（16），其次是podzols（6），无量子的kastanozems（3），单位luvisols（Haplic luvisols（2），petis calcis calcis calcissols（1），1）Gleysols（1）。最酸性的土壤是在奥地利（pH 4.73）收集的，西班牙的土壤最高（7.89）。在每个重复位点中，将七个1×1 m2的地块排列至少5 m。我们取出了植被和石头，并用3厘米直径的土壤芯（0-15 cm）从每个地块中随机采样了四个土壤芯。我们用乙醇70％和蒸馏水仔细地对收集工具进行了灭菌，并用手套对土壤进行了采样，以避免交叉污染。将土壤岩心汇合并以4 mm的形式筛选，以每个重复位点形成一个均质的复合土壤样品。将土壤样品在冷盒中运输到实验室，并在分析或建立缩影之前在4°C下储存。我们通过将100 g的新鲜土壤浸入水中过夜，并在18°C下4小时后测量饱和度（100％WHC）的水量来测量WHC。我们在105°C干燥48小时后确定了土壤水分含量。这些信息用于计算与100 g干燥土壤相对应的新鲜土壤的数量，并在实验过程中维持微观的水分。
For each replicate site, fresh soil was thoroughly mixed and dispatched into 20 pots (240 ml, 7.6 cm diameter across the top). We subsampled 20 and 5 g of soil for instant determination of initial soil moisture and nutrient concentrations, and stored 4 g of soil at −20 °C for DNA-based analyses. Considering the variability in soil density, WHC or initial moisture of soil derived from the different sites, the amount of soil per microcosm was standardized by dry weight (100 g dry weight per pot). Microcosms were placed for 7 days in a Percival AR-66L2 growth chamber (CLF PlantClimatics), open to the air, at 18 °C to allow acclimatization of microbial communities and adjustment of soil moisture to 60% WHC with milliQ water. Following this period, microcosms were randomly divided into five treatments. Temperature and moisture parameters were manipulated as follows for 14 days: control (18 °C, 60% WHC), drought (18 °C, 10% WHC), flood (18 °C, 100% WHC), freeze (−20 °C, 60% WHC) and heat (35 °C, 60% WHC). Application of these treatments for 2 weeks imposed extreme disturbance on soils from all locations used—for example, temperatures of −20 °C do not commonly occur even in Arctic soils48 whereas 35 °C is rarely exceeded in semiarid systems and during extreme heatwaves49,50. All treatments were placed in the same growth chamber and grouped by replicate site, where control exhibited the same environmental parameters as the acclimatization period: for drought we stopped watering the pots when moisture reached 10% WHC (Supplementary Fig. 4) and, for flood, microcosms were placed in plastic cups and submerged 1 cm above the soil surface. Freeze and heat samples were placed in a separate freezer and growth chamber, respectively, for the duration of the disturbance. At the end of the disturbance, one set of microcosms was harvested (see below) and the remainder returned to the main growth chamber, randomized within block (replicate site)。干旱的水分含量恢复到60％的WHC，对于洪水，将缩影排干，直到达到适当的水分含量为止（补充图4）。为了将水分含量保持在60％WHC，每2天用MILLIQ水每2天重量浇水。我们在四个采样时间下牺牲了一个缩影，每个复制位点：干扰末端（S1）和1（S2），8（s3）和26（s4）天后，在干扰结束后（5×3 = 15 pots a Chartest）。这导致了总共600个微观：10个国家×3重复位点×5处理×4个抽样时间。由于土壤量不足，因此将S2的十个俄罗斯样品排除在研究之外。
在每个采样时间，我们通过将缩影放入用铝箔覆盖的500 ml气密基尔纳罐中来测量黑暗中温室气体的排放。密封罐子，并在0、10、20和30分钟的注射器中依次在顶空中取出10 ml气体样品。将气体样品转移到20 mL预脱离的玻璃小瓶中，以及通过气相色谱法分析的CO2，N2O和CH4浓度（GC Agilent 7890B）。所有气体浓度均基于土壤干重（每克每小时干土壤的气体微克气体）转化为通量。考虑到两个顶空体积的变化（土壤的散装密度不同，取决于它们的起源，并且在每次测量时温度下降）和温度。然后将微观透明质量化，立即采样20和5 g，以确定土壤水分和养分浓度。此外，我们在-20°C下存储了52 g（40+（6×2 g））的土壤，用于基于DNA的分析，microRESP和酶促曲线。冻结后3个月内提取DNA。
在初始土壤样品（n = 30）中溶解的碳和氮和所有微观（如上所述的n = 590，600-10-10俄罗斯样品）均在5 g土壤（新鲜重量）中从35 ml Milliq水中提取，在220 rpm，并在4,000 rpm处搅动15分钟。通过纤维素纸（Whatman No。1，11 µm）和注射器过滤器（0.45 µm）过滤水提取物，并将滤液在4°C下储存最多15天。在密封自动分析仪3分段的流动多化学分析仪（MEQUON）上分析滤液以测量溶解的氮。通过从5000A TOC分析仪（Shimadzu）上分析的相同过滤物（Shimadzu）中获得从总溶解的N.溶解的N.溶解的N.溶解的N. N.溶解的N. N.溶解的无机N（NH4+-N和NO3--N）获得溶解的有机氮。通过水方法使用2：5新鲜土壤：milliq水在初始样品（30个样品）上测量土壤pH。总土壤C和N通过高温度燃烧（150 mg烤箱干燥的地面子样本），然后在Vario El Cube（Elementar Analysensysteme）上进行热导电测定。
通过MicroRESP Method51在S1和S4（280个样品）收集的土壤样品上测量底物诱导的呼吸谱。将土壤在4°C下解冻过夜。我们使用了微板填充装置（300 µL）来标准化深孔微板孔中添加的土壤体积（1.2 mL），并记录了添加的土壤质量。我们用pH指示剂凝胶制备了检测微板板，以估计通过颜色法产生的二氧化碳量（3％琼脂，2.5 mM NaHCO3，150 mM KCl和12.5 µg ml -1 cresol红色）。我们分别分配了与土壤微生物活性相关的八个底物溶液：水，葡萄糖，果糖，羧甲基纤维素，柠檬酸，苹果酸，丙氨酸，丙氨酸或天冬氨酸。将碳底物准备成12 mg C G -1土壤/水的浓度，平均对应于30 mg葡萄糖G -1土壤/水溶液。在Clario Star微调读取器上在570 nm处确定检测板的初始吸光度。在测量最终吸光度之前，我们在25°C下在25°C下在25°C下孵育密封的系统深孔微板/检测板。根据参考文献计算呼吸速率（每克每克干土壤的二氧化碳二-C微克）。51。
酶促活性测定在S1和S4的土壤样品上进行。使用参考资料，使用参考资料中所述的协议，评估了乙酰基酶，β-葡萄糖苷酶，磷酸酶和亮氨酸 - 氨基肽酶的乙酰基酶，β-葡萄糖苷酶，磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶的评估，并使用参考文献中所述。52。简而言之，将1.5 g冷冻的土壤与20 ml毫升的水混合，并在400 rpm下摇动20分钟。我们将30 µL的土壤溶液添加到含有170μl底物溶液300 mm的微孔板中，并在28°C下孵育3小时。
我们根据制造商的说明（QIAGEN），使用Dneasy Powersoil Pro Kit提取了从初始样品（n = 30）和缩影样品（n = 600 - 10）中提取总DNA（n = 600 - 10）。将管子在FastPrep-96仪器（MP BioMedicals）上以最大速度在1,200 rpm的1,200 rpm处旋转10分钟，并将DNA在80 µL洗脱缓冲液中洗脱。DNA完整性和质量通过在75 V时在1.5％琼脂糖凝胶上运行DNA样品55分钟来验证，并使用Clario Star Microplate读取器（BMG LabTech）检查280：260的吸光度比。我们使用Quant-IT DSDNA宽范围测定试剂盒（Life Technologies）使用Clario Star Microplate读取器对DNA浓度进行了荧光测定。DNA溶液在三个试管中分配，并在-20°C下储存，直到用于全胶原质组测序以及原核和真菌质量元法。
Prokaryotic and fungal community composition of the initial and microcosm samples at all sampling times (n = 620) was assessed by sequencing the V4–5 region of 16S rRNA genes using the primers 515 forward GTGYCAGCMGCCGCGGTAA and 806 reverse GGACTACNVGGGTWTCTAAT53, and established primers fITS7（GTGARTCATCGAATCTTTG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）分别编码ITS2区域54。我们遵循了地球微生物组Project55的PCR方案，并使用V3 Chemistry（Illumina）的Illumina Miseq平台上使用两步NEXTERA方法进行了测序。我们在r中使用了DADA2 V.1.24管道56进行修剪，质量过滤器Denoise和删除序列，以生成ASV表并分配分类法。2019年2月2日发布的Unite动态数据库和2018年3月发布的Silva SSU R132分别用于真菌和细菌分类学分配。中位数读数分别为32,200（四分位数范围（IQR）25,631–38,508）和16s及其的中位数读数分别为16S和38,410（IQR 31,831044,246）。来自西班牙的两个重复位点（位点1和3; n = 42）加上另外两个单独的样本，因为DNA产量低和读取较差，尤其是对于原核生物扩增子，将其排除在分析之外，总共有574个样本。
为了确定我们初始样品的功能基因组成和在S1和S4处的缩影，通过基因组研究中心（28个初始样品（ES1和ES3排除）+28个复制位点×2个采样时间×5处理时间= 308个样品），对整个元基因组进行了测序。使用TRUSEQ PCR无PCR试剂盒（350个基准对（BP）插入物）和Shotgun在Novaseq平台的四个车道中使用S4化学（2×150 bp配对端）制备了Illumina未放大片段库。使用Cusadapt（v.1.2.1）检测并除去Illumina适配器序列，然后使用镰刀1.200进行修剪之前，使用最低窗口质量得分为20，并且排除读数短于15 bp。然后使用Diamond BlastX（V.0.8）57在功能上注释前进读数，并使用SAMSA2管道（v.2）的脚本和过程和随附的SAMSA格式化种子子系统数据库58。元基因组的中值读数为6,398,524（IQR 4,704,883–8,216,799）。
所有统计分析均在R软件v.4.2或以上59中进行，大多数图是使用GGPLOT2 v.3.3（参考文献60）生成的。自定义代码中使用的R包（代码可用性）来协助核心分析和绘图是：扫帚。混合0.2（参考文献61），CAR 3.1（参考文献62），牛皮变量1.1（参考文献63）（参考文献63），Eulerr 7.0（参考文献64）（参考文献64），fs 1.6（Ref。65）（参考文献65），Ggordiplots 0.4（Ref。66）。ggrepel 0.9 (ref. 67), Hmisc 5.1 (ref. 68), lmerTest 3.1 (ref. 69), magrittr 2.0 (ref. 70), pacman 0.5 (ref. 71), CARTOcolors 2.1.2 (ref. 72), pracma 2.4 (ref. 73), RColorBrewer 1.1 (ref. 74), seqinr 4.2 (ref. 75) andTidyverse：2.0（参考文献76）。
为了可视化治疗，国家，现场和抽样时间对分类和功能基因丰富数据的相对重要性的相对重要性，以及土壤功能的度量，我们使用NMDS分析进行了NMDS分析，该分析使用素食包装77中的功能元素进行了分析，Bray -Curtis差异差异，以对局部RDA和社区的构成（可视化）的关系（随后构成了综合效果）RDA）。为了测试包含不同数量的国家 /地区的效果，在所有四个RDA轴上概括了通过干扰处理解释的总方差。为了量化对分类学和功能性基因丰度数据的治疗效果，以及土壤功能的测量，对所有初始样品除了所有样本外，都进行了Permanova，测试了干扰，抽样时间及其与国家和现场的相互作用的影响。这是使用纯素食包中的Adonis2函数实现的，该素食包装在Hellinger转换计数和999个排列中的Bray-Curtis差异。以上所有对β多样性的评估都使用了稀疏数据（素食主义者的rararefy功能），标准化为读取数量最低的样品（2,043个细菌读数，4,091个真菌读数和496,126个功能读数）。
为了识别不同的响应类别，我们使用NLME R Package v.3.1（参考文献78）中的LME函数将线性混合效应模型拟合到每个ASV。这些模型拟合了干扰处理，采样时间（从S1的天数）及其在ASV相对丰度上的相互作用的固定影响。在国家 /地区内，包括对截距的随机影响。用采样深度（使用NLME软件包中的VARConstProp函数考虑了添加剂和比例误差）以及每个采样点（S1-4），考虑了方差（异构性和比例误差）的差异。在每种情况下，都记录了零（通过WALD检验的p≤0.05）的差异和显着性，以记录治疗效果（S1处对照中的相对丰度差异）和相互作用项（相互作用项的相对丰度差异）（相对丰度的斜率差异在对照中与对照相对丰度的斜率差异）。这些被用来根据抵抗力（显着积极或负面影响或抗性，在S1时没有显着影响）和弹性（是否有弹性 - 相对的相反方向上的相反方向上的相对方向变化，或者在影响相同的方向上有明显的变化；或稳定上的显着变化；
这些策略的系统发育聚类是通过构造500个最丰富16S及其ASV的树，每种都使用kmer和二级结构引导的对准与Decipher R package v.2.24的Alignseqs对齐（参考文献79）。Trees were constructed using FastTree v.2.1 (ref. 80), with pseudocounts and a generalized time-reversible (gtr) model and rooted at the split between archaea and bacteria for both 16S sequences and fungi at the split between an outgroup comprising ASVs identified as belonging to the basal-branching phylum Chytridiomycota81 and the other taxa.对于每种干扰，使用R82中的CAPER V.1.0套件拟合了扰动和变化的影响和变化的系统发育最小二乘模型（即处理和处理：每种ASV的时间效应）。该方法根据Pagel的Lambda83估计系统发育信号的值和置信区间。
为了估计功能基因类别的抗性和弹性，首先计算了在种子子系统分类的每个级别上功能基因的Arcsine Square-root转换的相对丰度84。使用LME4 V.1软件包85将混合效应模型拟合到这些值。该模型使用处理时间和抽样时间为固定效应，位点嵌套在国家和所有较低的种子子系统水平（Level2/Level3/Level4）作为对截距的随机影响。此外，适合每个国家的观察级随机效应（即特定样本中特定读数计数的一个水平，对于种子类别中的特定基因），以允许国家之间的差异不同（即异性差异）。然后以与上述ASV模型相同的方式（分别处理和治疗：时间相互作用）从模型中提取估计的电阻和弹性效应。获得了这些处理对比的显着性的P值，其中使用Dunnett的测试和明确计划的治疗和治疗对比度，考虑了MultComp v.1.4套件中GLHT函数的多次比较：时间：时间。
我们使用细菌起源和细菌末端的比例来定量整个社区的细菌生长。由于细菌染色体从单个起源复制到末端，因此，积极生长的细菌种群平均而言，拷贝数的梯度从末端到原始量增加到了原始生长87，这是用于识别元素数据88,89,90特定微生物的增长速度的基础。我们将匹配与DNAA蛋白序列（复制引发剂蛋白）为细菌起源的标志，在该蛋白质序列中始终发现了91，而DIF DNA序列是染色体二聚体分辨率机械和细菌Termi92标记的染色体二聚体分辨率机械的宽28 bp结合位点，特定于群落中的标记。对于每个样本，我们将配对的元基因组读取文件之一（R1）与来自RefSeQ93 Refseq93版本215的39,401个DNAA序列的数据库以及一组578 difences92匹配。为了鉴定DNAA序列，我们在“非常敏感”的翻译（BLASTX）模式中使用了Diamond v.2.0（参考57），将至少一匹匹配的E值为0.001或更少的每个序列计数为命中。为了鉴定差序列，我们使用了buspn-short任务设置，使用了核苷酸BLAST v.2.13（BLASTN94），计算每个序列至少一匹匹配的电子价值为0.01或更少。原点和末端命中计数通过在每个治疗样本中的原点命中与末端命中的比率之间的差与未扰动的对照样品中的等效值之间的差异转化为相对细菌生长的估计值。使用混合效应模型分析了这些增长率估计值，该模型具有固定的治疗，抽样时间，Bray-Curtis与细菌和真菌群落的控制以及这些影响之间的所有可能相互作用的差异。包括对国家内嵌套的地点的截距的随机影响， 以及治疗对方差的影响，在上面的R中使用LME功能。通过使用质量包v.7.3（参考文献95）中的stepaic函数逐步去除非显着效应，将这个完整模型降低为最小的适当模型。该简化的模型仅包含治疗，采样时间，真菌群落与控制的距离以及该距离和治疗之间的相互作用的主要影响。
使用raspergade16s v.0.0.1（参考文献96）对生长能力进行定量，以估计每个原核生物ASV每个单元的16S拷贝数。这给出了1个最常见的拷贝数，2作为中间拷贝数，范围为1-18。该估计值的置信度（完全置信度为1）是高度可变的（中值，0.58；范围为2.6×10-4 - 1.00）。将这些值与ASV丰度相结合，以创建每个样品的加权平均预期拷贝数，这是在治疗和对照之间进行比较的。
微生物社区结构（原核生物，真菌和元基因组而不是单个ASV或功能类别）的抗性和韧性被定义为S1和S4处于S1和S4的干扰和对照之间的负相似性（如果距离很高，电阻/抵抗力较高）14,97。要测试初始土壤，气候和微生物特性与微生物社区对极端事件（抵抗和弹性）的反应，以及这些初始特性与每个最高功能类别的初始特性与最初的相对丰度之间的关系，我们使用了样本之间的级别（Spearman）矛盾。我们还使用了距离矩阵之间的等级相关性，这些距离矩阵测量功能类别的相对丰度之间的bray – curtis差异与每种土壤特性的等级转换的个体土壤特性之间的欧几里得距离之间的差异相关性（酶：磷酸酶，磷酸酶，β-葡萄糖苷酶，leucosidase，leucosion-氨基氨基氨基肽酶和actecineplase citer sireesplicelesepliseleseptase; microreespliceplise; microreesplicelesspase; microreesplicesely; microreesplicesely;果糖，葡萄糖，甘氨酸和苹果酸C和n可用性：DOC，DON，DON，硝酸盐和铵在S1或S4时间点上。使用纯素食包装中的Mantel（）函数中的999个排列计算P值。在必要时，使用完整链接层次聚类在相关值的值时将热图聚集。
基于20个初始土壤和环境特性（四个初始土壤和环境特性（四个碳质量变量，八个沉淀变量和三个碳和nItrable variables，三个碳和nItrial-priagiable，八个碳和nItrable variables，八个碳和nItriak variables，八个初始土壤和环境，分别拟合了抗抗性和弹性的明确预测模型（分别与S1和S4的对照中的元基因组基因丰富度的差异差异）明确的预测模型（分别为s1和s4的对照组中的差异差异）明确的预测模型（分别为S1和S4的对照）的明确预测模型。时间。这些解释性变量均标准化为平均值为零，标准偏差为1，并用作随机森林模型98中的解释变量。该回归森林使用Randomforest R软件包（v.4.7）99拟合，带有10,000棵树和默认的MTRY参数（在每次拆分时随机采样的解释变量的三分之一）。进行了该模型的修改后的分组交叉验证，其中数据分为训练和测试集，每个培训集都包含来自每个国家的两个重复站点的数据；测试集包含来自第三个站点的数据。有19,683种独特的方法来进行这种分裂（在排除之后，请参见上文）。如上所述，随机森林模型适合这些训练集，并用于对每个相应的测试组做出预测。使用随机森林函数计算了每个测试集的解释的方差（确定系数）的比例。进行了替代分组的交叉验证，其中训练集包含来自六个国家的数据，测试组包括来自其余四个国家的培训集（选择了这些比例，因为它们可以估算每个国家的误差，并且接近上面使用的三倍的交叉验证比例）。有210种独特的方法可以进行这种拆分，并且拟合的模型和确定系数如上所述。对于两个交叉验证， 在每个扰动中每个位点的交叉验证模型中预测的观察值和跨跨验证模型预测的平均值之间计算了Pearson相关性。使用PDP R软件包（v.0.8）101创建了一个可视化感兴趣和响应之间的关系的部分依赖图，这也可视化了感兴趣和响应之间的关系，也考虑了其他预测量的平均效果。
该项目是与当地合作伙伴密切合作的计划和执行。遵守当地法律的采样，并获得了土地所有者的许可。所有本地合作伙伴都被包括为合着者。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。